用于蛋白質(zhì)順磁標(biāo)記的乙二胺四乙酸類探針的合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)順磁標(biāo)記領(lǐng)域，特別是一種用于蛋白質(zhì)順磁標(biāo)記的乙二胺四 乙酸類探針的合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，高分辨順磁核磁共振在生物大分子等結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究中發(fā)揮的作用 日益重要。此技術(shù)通過順磁中心的未配對(duì)電子與蛋白質(zhì)分子自旋核的相互作用來提供 豐富的長(zhǎng)程結(jié)構(gòu)限制信息，如順磁弛豫增強(qiáng)（paramagnetic relaxation enhancement, PRE)、贋接觸化學(xué)位移（pseudocontact shifts，PCS)、殘余偶極稱合（residual dipolar couplings，RDC)，利用這些順磁信息，我們可以進(jìn)一步研究生物大分子的空間結(jié)構(gòu)、生物功 能以及分子之間的相互作用（（a) 7；沿乂眉2010，46: 101-112. (b)也/W Tfer 沒2010，39: 387-405. (c) CXewTfee 2009，109(9): 4108-4139. (d) 邏？ Spectr, 2002, 40: 249-273 )〇
[0003] 由于大多數(shù)蛋白質(zhì)沒有順磁中心，為獲得上述順磁信息就需要借助合適的雙功能 順磁探針，并通過與蛋白質(zhì)定點(diǎn)連接來實(shí)現(xiàn)。連接后，由于順磁效應(yīng)，順磁中心附近氨基酸 殘基的化學(xué)環(huán)境會(huì)發(fā)生較大的變化，導(dǎo)致核磁共振譜峰的化學(xué)位移亦發(fā)生明顯改變，進(jìn)而 得到PCS、PRE或RDC等相關(guān)順磁數(shù)據(jù)。由此看來，雙功能順磁探針的設(shè)計(jì)與合成在蛋白質(zhì) 順磁研究中尤為重要/#期7? Tfeso/?, 2014，31(2)，155-171)。
[0004] 通過有機(jī)化學(xué)手段合成的雙功能順磁探針通常由以下兩個(gè)不同的單元構(gòu)成：1) 一 個(gè)具有很強(qiáng)金屬離子螯合性能的基團(tuán)；2)-個(gè)可與蛋白質(zhì)定點(diǎn)連接的活性反應(yīng)基團(tuán)。前者 可以螯合具有不同順磁物理特性的金屬離子(如鑭系金屬離子，過渡金屬離子)，即順磁中 心；后者與蛋白質(zhì)上唯一的活性氨基酸殘基(如半胱氨酸、非天然氨基酸）反應(yīng)，可達(dá)到對(duì)蛋 白質(zhì)定點(diǎn)選擇性標(biāo)記的目的，從而進(jìn)一步用于蛋白質(zhì)順磁研究。
[0005] 為獲得良好的順磁數(shù)據(jù)，在設(shè)計(jì)探針時(shí)，含有多氨基多羧基的螯合配體常被用 作為理想順磁探針的基本骨架。從探針的骨架結(jié)構(gòu)出發(fā)，又可將其劃分為兩大類，一 類以非環(huán)狀結(jié)構(gòu)的乙二胺四乙酸（EDTA)、二乙烯三胺五乙酸（DTPA)、2,6-吡啶二甲氨 基-N，N，N' K -四乙酸（PyMTA)等衍生物為主，另一類以環(huán)狀結(jié)構(gòu)的1，4, 7, 10-四氮雜環(huán) 十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸（DOTA)等衍生物為主，這些探針均可與順磁金屬離子配位形成 熱力學(xué)穩(wěn)定的配合物。圖1中列出了已報(bào)道的部分代表性的順磁探針。
[0006] Gaponenko 等人（J 沿 〇?〇/·眉2002，24: 143 - 148)將已商業(yè)化的 EDTA 系 列探針，即圖1中的化合物L(fēng)-1，通過活化巰基的方法定點(diǎn)標(biāo)記到目標(biāo)蛋白質(zhì)。其中，EDTA 作為配位化學(xué)中應(yīng)用廣泛的有機(jī)螯合配體，可與金屬離子穩(wěn)定結(jié)合。他們使用此探針在滴 加 Co2+和Yb 3+后，成功獲得了 PCS和RDC數(shù)據(jù)，并得到溶液中對(duì)稱二聚體蛋白質(zhì)中每個(gè)單體 的結(jié)構(gòu)信息。
[0007] Prudgncio 等人（泛6?·及/r. 7；，2004，10: 3252 - 3260)報(bào)道了 DTPA 系列探 針，即圖1的化合物L(fēng)-2,此類探針具有8個(gè)螯合位點(diǎn)且與順磁金屬離子形成非常穩(wěn)定的配 合物。此外，它包含兩個(gè)活性巰基，由DTPA雙酸酐與S-(2-氨乙基）甲基硫代磺酸反應(yīng)得 至IJ，可以和目標(biāo)蛋白質(zhì)上距離8~1〇Α的兩個(gè)半胱氨酸殘基同時(shí)反應(yīng)，生成兩個(gè)二硫鍵，從而 增強(qiáng)了探針的剛性，限制了探針與蛋白質(zhì)間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)，避免了 PCS平均化，但兩個(gè)半胱氨 酸殘基的位置需仔細(xì)斟酌，含有多個(gè)半胱氨酸的蛋白質(zhì)在表達(dá)和純化過程中也有可能二聚 或沉淀。在與蛋白質(zhì)連接，滴加順磁金屬離子后，其NMR譜圖至少有5套信號(hào)峰，HSQC譜圖 非常復(fù)雜，難于分析。故此探針常用于獲得PRE作為限制條件來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
[0008] Graham 等人（沿oco/u·收ate 泛6?· 2011，22，2118-2125)報(bào)道了 DOTA 大環(huán)類 探針，即圖1中的化合物L(fēng)-3,這種大環(huán)化合物具有較為特殊的空間構(gòu)象，可與順磁金屬離 子形成高配位化合物，對(duì)稱性高，結(jié)合緊密，具有高度熱力學(xué)穩(wěn)定性，可有效減少非特異性 反應(yīng)發(fā)生，獲得較大的PCS，但形成配合物的過程較為緩慢，通常需要長(zhǎng)時(shí)間的加熱或回流 才能制備。相比之前的DOTA類探針，它在氮原子上引入了手性官能團(tuán)，可獲得更好的動(dòng)力 學(xué)惰性和更少的非對(duì)映異構(gòu)體，即環(huán)上氮原子與金屬離子配位后不會(huì)表現(xiàn)出手性問題，避 免出現(xiàn)多套峰而造成NMR譜圖復(fù)雜化。
[0009] Su 等人（泛6?·及/r. 7； 2013，19，1097 - 1103)報(bào)道了化合物 4VPyMTA，即圖 1 中的化合物L(fēng)-4。此探針自身具有高化學(xué)穩(wěn)定性，通過活性雙鍵與蛋白質(zhì)中的巰基選擇性反 應(yīng)連接。它具有七個(gè)螯合位點(diǎn)，可與順磁金屬離子形成七配位化合物，結(jié)合非常緊密。盡管 它與巰基的反應(yīng)速率較慢，但在多數(shù)情況下，它更具有選擇性，且連接后非常穩(wěn)定，可用于 原位分析蛋白結(jié)構(gòu)。此外，它剛性強(qiáng)，與金屬離子配位后構(gòu)象單一，不存在手性問題，可獲得 干凈和高品質(zhì)的順磁核磁譜圖，便于數(shù)據(jù)分析。
[0010] 綜上，在設(shè)計(jì)與合成一個(gè)性能優(yōu)越的雙功能順磁探針時(shí)，需綜合考慮以下幾方 面： 1)對(duì)順磁金屬離子具有很強(qiáng)的螯合能力。順磁金屬離子一般可形成多配位化合物，其 中鑭系金屬離子的配位數(shù)高達(dá)8-9個(gè)，因此順磁探針需要有多個(gè)螯合位點(diǎn)與之結(jié)合，使順 磁中心剛性增強(qiáng)，提高NMR譜圖的分辨率。此外，被螯合金屬離子應(yīng)接近蛋白質(zhì)表面，距離 太遠(yuǎn)將不利于蛋白質(zhì)順磁核磁研究。
[0011] 2)體積較小，剛性連接。若順磁探針體積較大，會(huì)因空間位阻等原因造成連接效率 低或無法連接，在一定程度上也會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能；若與蛋白質(zhì)連接后剛性不強(qiáng)， 對(duì)蛋白質(zhì)會(huì)出現(xiàn)相對(duì)運(yùn)動(dòng)，則會(huì)造成PCS和RDC明顯降低。
[0012] 3)沒有手性，構(gòu)象單一。順磁探針和順磁金屬離子配位后若產(chǎn)生多個(gè)非對(duì)映異構(gòu) 體，NMR譜圖中會(huì)因出現(xiàn)多套峰，導(dǎo)致譜圖復(fù)雜而難以分析。
[0013] 4)水溶性良好。水溶性好的順磁探針能更好的在生理?xiàng)l件下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定點(diǎn)修 飾。
[0014] 當(dāng)然，對(duì)順磁探針而言，與蛋白質(zhì)連接一端活性基團(tuán)的優(yōu)化也極為重要，在以 往的研究中，通過二硫鍵將含有活化巰基的探針與蛋白質(zhì)連接的方法應(yīng)用最為廣泛 泛￡皿5bc.，2009，131: 14761 - 14767)。此外，巰基與缺電子烯烴的硫醇烷基化 也能達(dá)到很好的連接效果，同時(shí)也突破了二硫鍵連接時(shí)連接產(chǎn)物在還原條件下不穩(wěn)定的 限制（泛￡?.及