一種細胞因子顆粒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及利用生物工程技術(shù)制備的細胞因子顆粒及其 在體外刺激單核細胞分化與擴增的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫細胞治療技術(shù)的發(fā)展使免疫科學(xué)的應(yīng)用發(fā)生重大變化，其針對腫瘤的療效正 在改變腫瘤患者的生存期和生存質(zhì)量。例如，自體免疫細胞療法，通過從腫瘤患者外周血中 分離出單個核細胞，使用含有針對性的刺激因子的培養(yǎng)液，刺激淋巴細胞的增殖和分化，使 其數(shù)量增多并具備抗瘤特異性，然后回輸?shù)侥[瘤患者體內(nèi)，對腫瘤有明顯的治療效果。這些 應(yīng)用的免疫細胞包括：LAK細胞，TIL細胞，CIK細胞，T細胞，NK細胞，DC細胞，DC-CIK細胞 等。
[0003] 體外淋巴細胞分化和擴增的效率取決于刺激因子，其中以細胞因子為主。對于一 定數(shù)量的單個核細胞，不同的刺激方法和不同的細胞因子會使刺激效率造成較大差異，差 異包括淋巴細胞增殖所需要的時間，細胞狀態(tài)和活力。一般地，使用常規(guī)細胞因子蛋白刺激 單個核細胞，因為細胞因子蛋白通常是小分子蛋白，對細胞的刺激作用較緩慢，而細胞增殖 緩慢，會導(dǎo)致所獲得的細胞總量中老化細胞所占的比例升高，從而影響整體細胞的狀態(tài)和 活力。因此，使細胞較快速度增殖，提高細胞整體狀態(tài)的一致性，是保證整體細胞狀態(tài)和活 力的有效辦法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)的細胞因子蛋白單獨作用效果較弱的不足，本申請進行了研宄，尋 求一種改善的刺激單個核細胞分化與擴增的方法，及其中利用的細胞因子顆粒。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供一種細胞因子顆粒，其中，所述顆粒包括細胞因子和gag蛋白。
[0007] 優(yōu)選的，所述顆粒的表面負載或展示所述細胞因子。優(yōu)選的，所述顆粒通過細胞分 泌的方式形成。
[0008] 優(yōu)選的，所述顆粒還包括共刺激分子。更優(yōu)選的，所述共刺激分子為CD137L。
[0009] 優(yōu)選的，所述的細胞因子，可以是一個或者多個。
[0010] 優(yōu)選的，所述的細胞因子，包括但不限于白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、集落 刺激因子、生長因子和/或趨化性細胞因子。更優(yōu)選的，所述細胞因子是白細胞介素。
[0011] 本發(fā)明還提供一種表達載體系統(tǒng)，其中所述表達載體系統(tǒng)包括（1)包含重組蛋白gag基因序列的載體和（2)包含細胞因子基因序列的載體。
[0012] 優(yōu)選的，所述表達載體系統(tǒng)還包括共刺激分子基因。更優(yōu)選的，所述共刺激分子為CD137L。
[0013] 優(yōu)選的，所述載體是質(zhì)粒。更優(yōu)選的，所述質(zhì)粒為真核表達載體pCMV。
[0014] 優(yōu)選的，所述的細胞因子，可以是一個或者多個。
[0015]優(yōu)選的，所述的細胞因子，包括但不限于白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、集落 刺激因子、生長因子和趨化性細胞因子。更優(yōu)選的，所述細胞因子是白細胞介素。
[0016]本發(fā)明還提供一種宿主細胞，其中，所述宿主細胞包含上述表達載體系統(tǒng)。優(yōu)選 的，所述宿主細胞表達細胞因子和gag蛋白，通過細胞分泌形成包含細胞因子和gag蛋白的 顆粒。更優(yōu)選的，所述顆粒還包含共刺激分子。更優(yōu)選的，所述共刺激分子為CD137L。
[0017]優(yōu)選的，所述的宿主細胞選自293T，293，A549等。
[0018] 優(yōu)選的，將所述表達載體系統(tǒng)導(dǎo)入宿主細胞中。優(yōu)選的，所述的導(dǎo)入方法，包括但 不限于磷酸鈣轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，陽離子轉(zhuǎn)染、電穿孔轉(zhuǎn)染，病毒載體導(dǎo)入，顯微注射。
[0019]本發(fā)明還提供一種上述細胞因子顆粒的制備方法。
[0020] 優(yōu)選的，所述制備方法，包括將上述的宿主細胞在合適的條件下表達，通過細胞分 泌形成顆粒。
[0021] 優(yōu)選的，顆粒上的表面可以負載和展示一種或多種細胞因子。
[0022] 優(yōu)選的，所述的gag基因序列如SEQIDNO. 1或SEQIDNO. 2所示。
[0023]本發(fā)明還提供一種上述細胞因子顆粒在制備刺激單個核細胞分化和擴增試劑中 的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明還提供一種上述細胞因子顆粒在刺激單個核細胞分化和擴增中的應(yīng)用。優(yōu) 選的，所述應(yīng)用在體外進行。更優(yōu)選的，所述應(yīng)用不是治療方法。
[0025]本發(fā)明還提供一種刺激單個核細胞分化和擴增的方法，將上述細胞因子顆粒體外 對單個核細胞進行刺激。優(yōu)選的，所述方法不是治療方法。
[0026]優(yōu)選的，根據(jù)不同的細胞因子組合可用于刺激單個核細胞分化成不同的免疫細胞 類型，其中包括NK細胞和/或T細胞。
[0027]本發(fā)明通過顆粒作為細胞因子的載體，能夠改善細胞因子對單個核細胞的刺激效 果，提高細胞因子的刺激效率。明顯提高單個核細胞分化和擴增NK細胞或T細胞的數(shù)量， 同時，NK細胞或T細胞分泌的細胞因子的數(shù)量和靶細胞殺傷率顯著提高。一方面，本發(fā)明的 細胞因子顆?？梢杂糜诖碳蝹€核細胞分化和擴增，另一方面，根據(jù)分化的免疫細胞類型 不同，而分泌不同的具有更強活性的細胞因子，即可以用于制備細胞因子，例如細胞因子顆 粒刺激單個核細胞分化和擴增NK細胞或T細胞，隨后NK細胞或T細胞分泌干擾素和腫瘤 壞死因子，即本發(fā)明的細胞因子顆粒也可用于制備干擾素和腫瘤壞死因子等細胞因子。并 進一步應(yīng)用于臨床或者研宄。
【附圖說明】
[0028] 圖1制備質(zhì)粒示意圖
[0029] 圖2實施例3中PBMC增殖細胞計數(shù)
[0030] 圖3實施例3中NK細胞殺傷活性
[0031] 圖4實施例4中PBMC增殖細胞計數(shù)
[0032] 圖5實施例4中NK細胞殺傷活性
[0033] 圖6實施例5中PBMC增殖細胞計數(shù)
[0034] 圖7實施例5中T細胞殺傷活性
【具體實施方式】
[0035] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進一步的說明。
[0036] 實施例1 :表達載體系統(tǒng)制備
[0037] 1、重組蛋白gag質(zhì)粒的制備
[0038] (1)核酸提取獲得gag基因的RNA :使用QIAGEN公司QIAamp Ultrasens virus試 劑盒對鼠白血病病毒MLV的核酸進行提取。
[0039] 具體方法：取Iml病毒樣品至2mlEP管并平衡溫度至15 °C-25 °C，加800yl BufferAC，加5. 6yIcarrierRNA到EP管蓋子里，然后漩渦振蕩IOs混勻；室溫培育10 分鐘，3200rpm離心3分鐘，棄去全部上清；加300ylBufferAR(60°C預(yù)熱）加20yl蛋白 酶K，漩渦振蕩使沉淀全部溶解；40°C水浴10分鐘期間漩渦振蕩一次5秒鐘，將其全部移入 QIAampSpinColumn6000rpm離心 1 分
[0040] 鐘棄去廢液；加500yIBufferAWl7500rpm離心1分鐘棄去廢液，加500y1 BufferAW2 15000rpm離心3分鐘棄去廢液，加30yIBufferAVE7500rpm離心1分鐘，收 集含RNA洗脫液，-20°C保存。
[0041] (2)逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA:用Invitrogen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（SuperScriptII)對抽提 的病毒RNA進行逆轉(zhuǎn)錄
[0042] 具體方法：取I. 5ml離心管，加去離子水5y1、隨機引物（IOuM)Iy1、樣品RNA 5y1、dNTPmix(lOmM)Iy1，65°C孵育 5 分鐘后置于冰上，加 5XFirst-strandBuffer 4yl、0.1M、DTT2yl、RNase0UTlyl，25°C孵育 2 分鐘，加SuperScript?IIRTlyl，25°C 孵育10分鐘，42°C孵育50分鐘，70°C孵育15分鐘，取2yI逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增。
[0043] ⑶擴增cDNA中的gag基因的PCR產(chǎn)物：分別使用
[0044] F-primer:TCACCGTCGTCGACGAATTCGCCACCATGGGCCAGGCTGTTACCAC(SEQ ID NO. 3)
[0045] R-primer:GCCTGGTCTAGAGCGGCCGCTCATTACTCATCTTCTATGTTTAGGGTCAGC(SEQ ID NO. 4)
[0046]兩對引物，PCR擴增gag片段。PCR反應(yīng)體系：10XHigh Fidelity PCRBuffer 5 y I；10mM dNTP mixture Iyl；50mM MgSO4 2 y I ；Primer IOuM Forward/Reward I y I； Platinum Taq High Fidelity 0.5 y 1(2. 5unit);水37. 5 y I;逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 y 1?？偡磻?yīng) 體積50 y1。反應(yīng)條件：94°C2分鐘；94°C30秒，65°C40秒，72°C1分鐘，30個循環(huán)；72°C3 分鐘。
[0047] (4)構(gòu)建gag質(zhì)粒
[0048]用SacI線性化pCMV載體（質(zhì)粒載體示意圖見圖I)，gag基因的PCR產(chǎn)物，分別 進行1%瓊脂糖電泳〇^電泳緩沖液：1'1^108克、似260了4*21120 7.44克、硼酸55克， 去離子水定容至1L);切下回收目標(biāo)片斷和載體至以稱重的1.5mlEP管中，用QIAEXIIGel ExtractionKit純化：加入3倍體積的BufferQXl(IOOmg加 300yIQX1)。加 30yIBuffer QIAEXII然后50°C水浴10分鐘，期間每兩分鐘漩渦振蕩一次。13000rpm離心30秒，棄去 上清，加500yIQIAEXI洗一次，加BufferPE500y1洗兩次棄去上清，空氣干燥15分鐘 直至沉淀變白。加入20yITE漩渦振蕩30秒培育5分鐘，13000rpm，離心30秒將上清移入 I. 5mlEP管，測量濃度。
[0049] 根據(jù)Infusion技術(shù)原理，線性化pCMV載體兩端與gag基因片段兩端有15?25個 堿基重合，Infusion技術(shù)能使其根據(jù)重合部分定向拼接。使用Clonetech公司的Infusion試劑盒，具體操作如下：5X In-Fusion buffer 2yl，EnzymeIy1，線性化pCMV載體， gag基因的PCR產(chǎn)物，純化水，使總體積10y1。載體與各片段的用量滿足其摩爾比2:1。 Infusion混合液37°C處理15分鐘，50°C處理15分鐘，加入40yITE緩沖液，補足50y1， 取2. 5 y