耐鹽微藻的選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微藻的選育方法，特別是涉及一種耐鹽微藻的選育方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微藻是指那些在顯微鏡下才能分辨其形態(tài)的微小藻類類群，種類眾多且數(shù)量龐大，是生態(tài)系統(tǒng)中主要的初級(jí)生產(chǎn)者。由于微藻具有豐富的遺傳多樣性，其多種代謝產(chǎn)物，包括多糖、脂類、蛋白質(zhì)等在食品、醫(yī)藥、可再生能源等領(lǐng)域都具有良好的應(yīng)用前景。但是，一般藻種難以適應(yīng)人工環(huán)境，導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢，可提取的高價(jià)值成分含量低且提純困難等問(wèn)題，極大地阻礙了微藻的開(kāi)發(fā)利用。因此，選育生長(zhǎng)快速、抗逆境脅迫和高附加值活性物質(zhì)含量高等性狀優(yōu)良的藻種已經(jīng)成為微藻相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)的重要途徑。
[0003]目前常規(guī)的藻種選育方法主要為自然篩選、誘變育種和基因工程育種。誘變育種(中國(guó)專利公開(kāi) CN102776171A、CN103468575A、CN102888393A、CN103160494A)以物理或化學(xué)誘變劑誘發(fā)基因突變，通過(guò)篩選從眾多變異株中篩選出目標(biāo)性狀優(yōu)良的突變株。誘變育種特點(diǎn)是藻株突變率高，育種進(jìn)程快。但由于誘變的隨機(jī)性，難以有效地控制變異的方向和性質(zhì)，產(chǎn)生目的突變株頻率低，難以得到具有多種優(yōu)良性狀的突變株?；蚬こ逃N(中國(guó)專利公開(kāi)CN102827856A、CN104031934A)通過(guò)重組DNA等技術(shù)，引入外源目的基因或突變從而形成新品種，其特點(diǎn)是育種目的明確，性狀改良效果明顯，但其應(yīng)用需要大量的基因功能研宄基礎(chǔ)，且技術(shù)難度較高。
[0004]適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化技術(shù)(Adaptive laboratory evolut1n)是近年來(lái)出現(xiàn)的提高微生物在環(huán)境脅迫條件下耐受性的一種育種技術(shù)，在適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化過(guò)程中，微生物一直保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，并隨著培養(yǎng)條件的逐漸變化，穩(wěn)定地增強(qiáng)所需要的各種性狀。因此，該技術(shù)具有較好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種耐鹽微藻的選育方法。本發(fā)明通過(guò)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化技術(shù)提高微藻對(duì)高濃度鹽脅迫耐受性，取得了非常理想的效果，對(duì)選育高耐受性藻株及其應(yīng)用有著極其重要的意義。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的耐鹽微藻的選育方法，包括步驟:
[0007]I)將微藻藻株接種至初始培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)；
[0008]2)將培養(yǎng)后的微藻藻株接種至添加了氯化鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0009]3)以步驟2)為一個(gè)循環(huán)，將該藻株在添加了氯化鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)I?80個(gè)循環(huán)；
[0010]4)當(dāng)該藻株在添加了氯化鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基中生物量達(dá)到0.8-1.2g/L時(shí)，提高培養(yǎng)基中的氯化鈉濃度，繼續(xù)培養(yǎng)I?80個(gè)循環(huán)，使其生物量達(dá)到0.8-1.2g/L。
[0011]所述步驟I)中，微藻藻株包括:念珠藻目(Nostocales)藻類；該念珠藻目藻類，包括:念珠藻或魚(yú)腥藻等；接種的濃度為0.01?0.5g/L ;
[0012]初始培養(yǎng)基的組分包括:磷酸氫二鉀0.032-0.048g/L、七水合硫酸鎂0.06-0.09g/L、二水合氯化鈣 0.029-0.043g/L、碳酸鈉 0.018-0.022g/L、檸檬酸0.005-0.007g/L、檸檬酸鐵銨 0.005-0.007g/L、EDTA(乙二胺四乙酸)0.0009-0.0011g/L、微量元素溶液A51mL/L ;其中，所述微量元素液A5中的組分為:硼酸2.29-3.43g/L、二水合氯化錳1.45-2.17g/L、七水合硫酸鋅0.178-0.266g/L、鉬酸鈉0.312-0.468g/L、五水合硫酸銅 0.063-0.095g/L、六水合硝酸鈷 0.039-0.059g/L。
[0013]步驟I)中，培養(yǎng)的條件優(yōu)選如下:培養(yǎng)溫度為22-28°C，光照強(qiáng)度為50-200 μπιο1/(m2.s)，光照時(shí)間每天8-16h ;培養(yǎng)的程度優(yōu)選為培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
[0014]所述步驟2)中，接種的濃度為0.01?0.5g/L ;添加了氯化鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基中，氯化鈉的濃度優(yōu)選為0.59?5.85g/L ；
[0015]進(jìn)化培養(yǎng)基的組分包括:磷酸氫二鉀0.032-0.048g/L、七水合硫酸鎂0.06-0.09g/L、二水合氯化鈣 0.029-0.043g/L、碳酸鈉 0.018-0.022g/L、檸檬酸
0.005-0.007g/L、檸檬酸鐵銨 0.005-0.007g/L、EDTA0.0009-0.0011g/L、微量元素溶液A5 lmL/L ;其中，所述微量元素液A5中的組分為:硼酸2.29-3.43g/L、二水合氯化錳
1.45-2.17g/L、七水合硫酸鋅0.178-0.266g/L、鉬酸鈉0.312-0.468g/L、五水合硫酸銅0.063-0.095g/L、六水合硝酸鈷 0.039-0.059g/L。
[0016]所述步驟2)中，培養(yǎng)的條件優(yōu)選如下:培養(yǎng)溫度為22-28 ?，光照強(qiáng)度為50-200 μ mol/ (m2.s)，光照時(shí)間為每天8_16h，培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為2?10天;
[0017]所述步驟4)的提高培養(yǎng)基中的氯化鈉濃度中，將氯化鈉濃度提高至3.52?
11.70g/Lo
[0018]所述方法，還包括步驟:5)在上述步驟的基礎(chǔ)上，以每次0.59?5.85g/L的幅度不斷提高培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度，每次提高氯化鈉濃度后培養(yǎng)I?80個(gè)循環(huán)，直至培養(yǎng)基中氯化鈉最終濃度達(dá)到5.85-17.55g/L，同時(shí)使獲得的進(jìn)化藻株能夠在此條件下快速生長(zhǎng)并生物量明顯提高。
[0019]另外，本發(fā)明還提供一種通過(guò)上述方法所獲得的微藻。其中，所述微藻是一種耐受高濃度鹽的微藻，其能夠在高鹽濃度條件下快速生長(zhǎng)并明顯提高生物量，如該微藻在高鹽濃度(即NaCl的濃度為5.85?17.55g/L)條件下培養(yǎng)，生物量達(dá)到1.30?2.64g/L。
[0020]本發(fā)明的有益效果如下:
[0021]1、本發(fā)明提供的耐受高濃度鹽脅迫的微藻在高鹽濃度(100-300mM NaCl)脅迫條件下，比出發(fā)藻株具有更好生長(zhǎng)性能和生物產(chǎn)量。
[0022]2、本發(fā)明提供的選育方法簡(jiǎn)單易行，無(wú)需生物學(xué)研宄基礎(chǔ)，同時(shí)避免了誘變育種中使用誘變劑對(duì)人體可能帶來(lái)的傷害。
[0023]3、本發(fā)明提供的選育方法，利用特定脅迫條件，限定了藻株的進(jìn)化方向，漸進(jìn)性提高進(jìn)化藻株耐受能力，可快速直接獲得目的性狀提升的進(jìn)化藻株。
【附圖說(shuō)明】
[0024]下面結(jié)合附圖與【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明:
[0025]圖1是本發(fā)明的選育路線示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明的耐鹽微藻的選育方法，可按照?qǐng)D1所示的流程進(jìn)行操作，下面以具體的藻株進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0027]實(shí)施例1念珠藻(Nostoc sp.CM7)的選育方法
[0028]1、出發(fā)藻株
[0029]出發(fā)藻株為念珠藻(Nostocsp.PCC7120)。
[0030]2、選育方法
[0031]I)以念珠藻(Nostoc sp.PCC7120)為出發(fā)藻株，以接種濃度為0.03g/L，將其在初始培養(yǎng)基中在25°C下，光照強(qiáng)度為50 μπιοΙ/Ο?2 *s)，光照時(shí)間為每天12h，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；
[0032]其中，初始培養(yǎng)基的配方為:磷酸氫二鉀0.04g/L、七水合硫酸鎂0.075g/L、二水合氯化鈣0.036g/L、碳酸鈉0.02g/L、檸檬酸0.006g/L、檸檬酸鐵錢0.006g/L、EDTA0.001g/L、微量元素溶液A51mL/L ；
[0033]所述微量元素液A5的制備方法為:取硼酸2.86g、二水合氯化錳1.81g、七水合硫酸鋅0.222g、鉬酸鈉0.39g、五水合硫酸銅0.079g、六水合硝酸鈷0.049g用去離子水溶解后，再用去離子水定容至1L。
[0034]2)以接種濃度0.03g/L接種于含5.85g/L氯化鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基中，在25°C、光照強(qiáng)度為50 μ mol/(mff.s)、光照時(shí)間為每天12h，培養(yǎng)7天；
[0035]3)以上述步驟2)為一個(gè)循環(huán)周期，將該藻株在含5.85g/L氯