一種重組利迪鏈霉菌及其應(yīng)用
【專利說(shuō)明】-種重組利迪鏈霉菌及其應(yīng)用
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01210579816. 5、申請(qǐng)日為2012年12月27日、發(fā)明創(chuàng)造名稱 為"產(chǎn)納他霉素的重組利迪鏈霉菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用"的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，特別涉及一種重組利迪鏈霉菌及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 隨著農(nóng)作物種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整和栽培方式的變化，許多作物真菌性病害的發(fā)生和 危害日趨嚴(yán)重，如甘藍(lán)枯萎病（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)、小麥紋枯病菌 (R. cerealis)、桃褐腐病菌（M. fructicola)、蘋果輪紋病菌（B. berengeriana)、百合根腐 病菌（F. oxysporum)等病原菌的危害也十分嚴(yán)重（耿麗華等，2009)。一般的化學(xué)農(nóng)藥都難 以湊效，且頻繁使用增加了病原菌的抗藥性，污染了生態(tài)環(huán)境，因此亟待開發(fā)新的、環(huán)境友 好型的高效微生物農(nóng)藥已成為近年病害生防領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。
[0004] 納他霉素（natamycin)是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，也稱匹馬菌素或游霉 素（Pimaricin),分子式為C 33H47O13。研究報(bào)道natamycin對(duì)幾乎所有的酵母菌、霉菌 具有抗性，是一種極具有潛力的廣譜抗菌劑，能夠顯著抑制甘藍(lán)枯萎病菌（F. oxysporum f.s.conglutinans)、蘋果輪斑病菌（A.mali)、辣椒灰霉病菌（B.cinerea)、葡萄灰霉病菌 (13.(3；[116代3)、黃瓜枯萎病菌（?.；^8。.01101111161'；[1111111)、爺子早疫病菌（4.801311；0、番爺灰 霉病菌（B.cinerea)、桃褐腐病菌（M. fructicola)、李子褐腐病菌（M. fructicola)等病 原菌的生長(zhǎng)，并且不易產(chǎn)生抗藥性，在防治植物真菌病害方面顯示了良好的應(yīng)用前景（te Welscher et al.，2008 ;Du et al.，2009;隋勤等，2007)。此外，natamycin 作為食品防腐 劑是我國(guó)批準(zhǔn)使用僅有的2種食品生物防腐劑之一（另一個(gè)是乳酸鏈球菌素，Nisin)，還被 應(yīng)用于臨床醫(yī)療，用于治療真菌引起的皮膚和粘膜感染等（Davidson andDoan, 1993;程良 英，2010)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供納他霉素產(chǎn)量高的重組利迪鏈霉菌及其 構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的構(gòu)建重組利迪鏈霉菌的方法，包括將納他霉素合成正調(diào)控基因?qū)?入作為宿主菌的利迪鏈霉菌中篩選得到納他霉素產(chǎn)量高于所述宿主菌的重組利迪鏈霉菌 的步驟；
[0007] 所述納他霉素合成正調(diào)控基因編碼如下a)或b)的蛋白質(zhì)：
[0008] a)氨基酸序列如SEQ ID Nol所示的蛋白質(zhì)；
[0009] b)將SEQ ID No. 1中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與 納他霉素合成相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0010] 其中，SEQ ID No. 1由192個(gè)氨基酸殘基組成。
[0011] 上述方法中，所述納他霉素合成正調(diào)控基因的編碼序列為SEQ ID No.2的第 433-1011位。所述納他霉素合成正調(diào)控基因的序列具體可為SEQ ID No. 2的第14-1011 位。
[0012] 其中，SEQ ID No. 2由1019個(gè)核苷酸組成，第1-13位為NdeI識(shí)別位點(diǎn)和保護(hù)堿 基，第14-432位為紅霉素抗性基因啟動(dòng)子，第433-1011位為納他霉素合成正調(diào)控基因的編 碼序列，第1012-1019為EcoRI識(shí)別位點(diǎn)和保護(hù)堿基。
[0013] 上述方法中，所述將納他霉素合成正調(diào)控基因?qū)胱鳛樗拗骶睦湘溍咕?如下步驟：將所述納他霉素合成正調(diào)控基因的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中得到重組大腸桿 菌，再將所述重組大腸桿菌與所述作為宿主菌的利迪鏈霉菌進(jìn)行雙親接合獲得所述重組利 迪鏈霉菌；所述納他霉素合成正調(diào)控基因的表達(dá)載體中，啟動(dòng)所述納他霉素合成正調(diào)控基 因的啟動(dòng)子是紅霉素抗性基因啟動(dòng)子。
[0014] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述紅霉素抗性基因啟動(dòng)子的核苷酸序列是SEQ IDNo. 3。
[0015] 其中，SEQIDNo. 3由199個(gè)核苷酸組成。
[0016] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述納他霉素合成正調(diào)控基因的表達(dá)載體為將所述納他霉 素合成正調(diào)控基因插入PIB139的所述紅霉素抗性基因啟動(dòng)子下游得到的重組表達(dá)載體， 具體是將SEQ ID No. 2所示的DNA片段經(jīng)NdeI和EcoRI酶切后插入pIB139的NdeI和 EcoRI位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體pIB139-slnM。
[0017] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述作為宿王囷的利迪鏈霉囷可為利迪鏈霉 菌（Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654，所述大腸桿菌為去甲基化 E.coliET12567(pUZ8002)〇
[0018] 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供由上述任一種方法得到的重組利迪鏈 霉菌。
[0019] 所述重組利迪鏈霉菌具體可為利迪鏈霉菌AM02,其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 6815。
[0020] 本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供所述重組利迪鏈霉菌的用途。
[0021] 本發(fā)明所提供的用途是下述1)或2)或3):
[0022] 1)所述重組利迪鏈霉菌在生產(chǎn)那他霉素中的應(yīng)用；
[0023] 2)所述重組利迪鏈霉囷在制備植物病原真囷抑制劑中的應(yīng)用；
[0024] 3)所述重組利迪鏈霉菌在抑制植物真菌病害中的應(yīng)用。
[0025] 上述應(yīng)用中，所述植物病原真菌為下述至少一種：甘藍(lán)枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)和西瓜枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. niveum);所述植物 真菌病害為下述至少一種：由甘藍(lán)枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)引 起的病害和由西瓜枯萎病菌（F. oxysporum f.sp. niveum)引起的病害。
[0026]實(shí)驗(yàn)證明，利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus) AM02CGMCC No. 6815 納他 霉素產(chǎn)量在YEME培養(yǎng)基上約是野生型菌株利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus) A02CGMCCNO. 1654的3倍（圖3)，在發(fā)酵培養(yǎng)基上約是野生型菌株利迪鏈霉菌 (Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654 的 2 倍（圖 4)。利迪鏈霉菌（Streptomyces 1丫(1;[(3118)4]\10206]\0^1^〇.6815對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌（？11831'；[11111(?5^口01'11111；1^8口.（301^1111:;[仙118) 的抑菌活性是利迪鏈霉菌（51:代。1:01115^8 17(1;[(3118)40206]\1(1^〇.1654的1.8倍，對(duì)西瓜枯 萎病菌（F. oxysporum f. sp. niveum)的抑菌活性是利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654的2. 2倍。本發(fā)明的重組利迪鏈霉菌，具有比野生型顯著提高的產(chǎn)納他 霉素和抑菌能力，由于納他霉素可以作為食品保鮮劑及飼料添加劑，因此，本發(fā)明的重組利 迪鏈霉菌可以應(yīng)用于食品、生物能源及飼料添加等方面。
[0027] 生物材料信息
[0028]分類命名：利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus)
[0029] 菌株編號(hào)：AM02
[0030] 保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0031] 保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱：CGMCC
[0032] 地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)
[0033] 保藏日期：2012年11月12日
[0034] 保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：CGMCC No. 6815
[0035] 下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，這些實(shí)施例用于理解而不是限制本發(fā)明。
【附圖說(shuō)明】
[0036]圖 1 為 pIB139_slnM 的 NdeI 和 EcoRI 酶切結(jié)果。
[0037] 其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為pIB139_slnM。
[0038] 圖2為阿泊拉霉素抗性PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子的電泳圖譜。
[0039]圖 3 為利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus) AM02 和利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus) A02在YEME培養(yǎng)基中的納他霉素產(chǎn)量比較。
[0040]圖 4 為利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus) AM02 和利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus) A02在發(fā)酵培養(yǎng)基中的納他霉素產(chǎn)量比較。
[0041]圖 5 為利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus) AM02 和利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus)A02的抑菌活性比較。
[0042] A中的病原菌為甘藍(lán)枯萎病菌，左側(cè)為利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus)A02 對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌的抑菌圈，右側(cè)為利迪鏈霉菌（Str印tomyces lydicus) AM02對(duì)甘藍(lán)枯萎病 菌的抑菌圈。
[0043] B中的病原菌為西瓜枯萎病菌，左側(cè)為利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus)A02 對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌圈，右側(cè)為利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus) AM02對(duì)西瓜枯萎病 菌的抑菌圈。
[0044] 圖6A為利迪鏈霉菌活性產(chǎn)物的HPLC第一次分離譜圖。
[0045] 圖6B為利迪鏈霉菌活性產(chǎn)物的HPLC第三次分離譜圖。
[0046]圖7為納他霉素樣品的紫外掃描圖譜。
[0047] 圖8為納他霉素樣品的紅外吸收光譜。
[0048] 圖9A為納他霉素樣品的高分辨質(zhì)譜圖（負(fù)離子）。
[0049] 圖9B為納他霉素樣品的高分辨質(zhì)譜圖（正離子）。
[0050] 圖10A為納他霉素樣品的核磁共振碳譜（500MHz)。
[0051] 圖IOB為納他霉素樣品的核磁共振氫譜（500MHz)。
【具體實(shí)施方式】
[0052] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0053] 下述實(shí)施