一種用于將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種用于將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 基。具體地,本發(fā)明涉及使用化學(xué)成分完全明確的培養(yǎng)基,將人胚胎干細(xì)胞定向高效地誘導(dǎo) 生成心肌細(xì)胞;本發(fā)明還涉及一種用于將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)的研究調(diào)查表明,心臟疾病一直位于高致死疾病之首,而在心臟疾病中,心 肌梗死又是最主要的死亡病因。近年來(lái),隨著人們物質(zhì)生活水平的不斷提高,特別是高熱高 脂食物的攝入以及缺乏足夠的體育鍛煉,心肌梗死的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。心肌梗死 主要是由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致血管腔狹窄,血液供應(yīng)不足,從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死。眾 所周知,心肌細(xì)胞,特別是成年人的心肌細(xì)胞不再具有增殖能力。因此,心肌梗死后梗死區(qū) 域主要由纖維細(xì)胞和基質(zhì)形成瘢痕組織,導(dǎo)致左室重構(gòu),后期出現(xiàn)心力衰竭。
[0003] 傳統(tǒng)治療心肌梗死的方法主要有以下幾種:一、藥物保守治療;二、藥物溶栓治 療;三、支架植入術(shù);四、冠狀旁路搭橋術(shù)。這些治療手段只能緩解病情,改善病人的部分生 活質(zhì)量,并不能防止心室重構(gòu)以及隨后的心力衰竭。另外,在臨床上,針對(duì)終末期的心臟疾 病病人還可以進(jìn)行心臟移植,但是心臟供體來(lái)源極為有限,同時(shí)心臟移植后會(huì)出現(xiàn)免疫排 斥反應(yīng)。因此,從嚴(yán)格意義上來(lái)講,心肌梗死后通過(guò)這些治療手段并不能真正的治愈。
[0004] 近年來(lái),隨著干細(xì)胞研究的深入,許多具有生成心肌細(xì)胞潛能的多能干細(xì)胞被作 為細(xì)胞治療的種子細(xì)胞,譬如骨髓來(lái)源的干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞 及內(nèi)皮前體細(xì)胞等。但是,這些細(xì)胞移植后在體內(nèi)生成心肌細(xì)胞的效率及療效備受爭(zhēng)議。人 胚胎干細(xì)胞系(human embryonic stem cell,hESc)的建立開(kāi)創(chuàng)了再生醫(yī)學(xué)的新領(lǐng)域,與其 它治療性細(xì)胞相比,胚胎干細(xì)胞在體外可以無(wú)限自我更新增殖、在體外能夠高效的分化為 心肌細(xì)胞,這些特點(diǎn)使其在再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0005] 為了推進(jìn)胚胎干細(xì)胞類產(chǎn)品的臨床應(yīng)用,人們一直在不斷嘗試改進(jìn)優(yōu)化人胚胎干 細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)。James Thomson實(shí)驗(yàn)室在這個(gè)領(lǐng)域一直處于研究的最前沿。從最初的含有 20%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基,到找到替代胎牛血清的血清替代品(KOSR),以及包括含血 清白蛋白的mTSeR培養(yǎng)基。而優(yōu)化改良培養(yǎng)基最好的莫過(guò)于其實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的無(wú)飼養(yǎng)層、無(wú) 動(dòng)物源、化學(xué)成分明確的E8-vitronectin培養(yǎng)系統(tǒng)。但是,目前由胚胎干細(xì)胞向心肌定向 誘導(dǎo)分化系統(tǒng)不穩(wěn)定,如分化所得細(xì)胞均一性差、分化批次間效率及不同細(xì)胞系間的差異 性顯著等。與人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)化類似,將人胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的分 化培養(yǎng)系統(tǒng)也經(jīng)歷了組分成分由未知到確定、由復(fù)雜到簡(jiǎn)單、由動(dòng)物源到人源或者化學(xué)成 分明確的方向發(fā)展。早期分化得到心肌細(xì)胞主要是通過(guò)與小鼠的內(nèi)臟中胚層樣細(xì)胞(Mouse visceral endoderm-likecell,END-2)共培養(yǎng),或者通過(guò)類胚體(Embryonic body,EB)的 方法得到。但是這些方法得到的心肌細(xì)胞效率低。后來(lái)Charles Murry實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)了單層 細(xì)胞分化體系,通過(guò)在傳統(tǒng)1640和B27組成的基礎(chǔ)分化液中添加促心肌分化因子Activin A和BMP4,這種方法可以使心肌的分化效率提高到50%左右。無(wú)血清添加劑雖然去除了血 清成分,但其中仍含有大量的牛源或人源的血清白蛋白。2014年,Stanford大學(xué)Joseph 課題組僅僅用了三種組分:RPMI-1640、維生素C磷酸鹽(L-Ascorbic acid 2-phosphate) 和水稻重組的人血清白蛋白(rice-derived recombinant human albumin),在此基礎(chǔ)上再 添加人工合成小分子CHIR99021和Wnt-C59就可以將分化效率提高到80%。但水稻重組的 人血清白蛋白是必需的,且濃度高達(dá)〇.5mg/mL,而血清白蛋白批次間的差異會(huì)導(dǎo)致分化體 系的不穩(wěn)定。
[0006] 綜上所述,雖然很多實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了心肌誘導(dǎo)分化培養(yǎng)體系的摸索,但是依然存在 明顯的不足。人心肌細(xì)胞具有較大的臨床應(yīng)用潛能,如細(xì)胞移植治療心肌梗死、廣譜藥物篩 選以及藥物心肌毒理測(cè)試,而這些都需要大量的人心肌細(xì)胞。因此,當(dāng)前存在著對(duì)能夠提高 心肌誘導(dǎo)分化效率、無(wú)動(dòng)物源成分、化學(xué)成分明確的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的需要。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 因此,針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明首次對(duì)用于將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞的 培養(yǎng)基進(jìn)行了研究,并將其優(yōu)化到化學(xué)成分明確的狀態(tài),在這種優(yōu)化的培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下,能 夠1?效、穩(wěn)定的獲得心肌細(xì)胞。
[0008] 本發(fā)明的目的就是提供一種用于將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基,并且該 培養(yǎng)基的化學(xué)成分明確,從而為心肌細(xì)胞的臨床應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。
[0009] -方面,本發(fā)明提供一種用于將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基,所述培養(yǎng) 基為化學(xué)成分明確的液體培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI-1640 ;
[0010] 進(jìn)一步地,所述培養(yǎng)基還包括1?3mg/L的L-肉毒堿、0. 5?2mg/L的乙醇胺、 10?20mg/L的腐胺、0? 01?0? 02mg/L的亞硒酸鈉、0? 5?2mg/L的亞油酸、3?6mg/L的 轉(zhuǎn)鐵蛋白、50_200mg/L的維生素C和/或維生素C磷酸鎂鹽、以及50-500 ii M的N乙酰半胱 氨酸;
[0011] 優(yōu)選地,所述培養(yǎng)基還包括2mg/L的L-肉毒堿、lmg/L的乙醇胺、16mg/L的腐胺、 0? 016mg/L的亞硒酸鈉、lmg/L的亞油酸、5mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白、100mg/L的維生素C和/或維 生素C磷酸鎂鹽、以及200 M的N乙酰半胱氨酸;
[0012] 其中,所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的滲透壓值為295-305,優(yōu)選為300 ;
[0013] 優(yōu)選地,使用5M的氯化鈉儲(chǔ)液調(diào)節(jié)所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI-1640的滲透壓值;
[0014] 優(yōu)選地,所述培養(yǎng)基還包括胰島素;
[0015] 優(yōu)選地,所述胰島素在培養(yǎng)基中的濃度為2?6mg/L,更優(yōu)選為4mg/L。
[0016] 優(yōu)選地,所述培養(yǎng)基還包括誘導(dǎo)小分子;
[0017] 優(yōu)選地,所述誘導(dǎo)小分子為肝糖原合成激酶3 0 (GSK3 0)受體的選擇性抑制劑 CHIR99021、Wnt 受體抑制劑 IWRl 或 Wnt 抑制劑 wnt-c59;
[0018] 更優(yōu)選地,所述CHIR99021在培養(yǎng)基中的濃度為2-8iiM,還優(yōu)選地,為4iiM;進(jìn)一 步優(yōu)選地,所述IWRl在培養(yǎng)基中的濃度為2-8 ii M,還優(yōu)選為5 ii M;再優(yōu)選地,所述wnt-c59 在培養(yǎng)基中的濃度為1-5 ii M,還優(yōu)選為2 ii M。
[0019] 因此,在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述培養(yǎng)基包括下表1所示的組分:
[0020] 表 1
[0021]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基為化學(xué)成分明確的液 體培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI-1640 ; 進(jìn)一步地,所述培養(yǎng)基還包括1?3mg/L的L-肉毒堿、0. 5?2mg/L的乙醇胺、10? 20mg/L的腐胺、0. 01?0. 02mg/L的亞硒酸鈉、0. 5?2mg/L的亞油酸、3?6mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋 白、50-200mg/L的維生素C和/或維生素C磷酸鎂鹽、以及50-500yM的N乙酰半胱氨酸; 優(yōu)選地,所述培養(yǎng)基還包括2mg/L的L-肉毒堿、lmg/L的乙醇胺、16mg/L的腐胺、 0? 016mg/L的亞硒酸鈉、lmg/L的亞油酸、5mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白、100mg/L的維生素C和/或維 生素C磷酸鎂鹽、以及200yM的N乙酰半胱氨酸; 其中,所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的滲透壓值為295-305,優(yōu)選為300。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述培養(yǎng)基還包括胰島素;優(yōu)選地,所 述胰島素在