一種假交替單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)卡拉膠酶的培養(yǎng)基及發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及發(fā)酵的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種食鹿角菜假交替單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)卡拉膠酶的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]卡拉膠是從一些紅藻的細(xì)胞壁中提取到的天然海藻多糖，在生化、臨床、醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛?？ɡ烟鞘怯煽ɡz降解形成，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)植物生長等多種新型生理活性，相比卡拉膠具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0003]目前，卡拉寡糖一般通過傳統(tǒng)的化學(xué)和物理降解的方法獲得，但是傳統(tǒng)方法制備卡拉寡糖存在著反應(yīng)條件難控制、降解產(chǎn)物不均一、損耗多、污染環(huán)境等問題，而酶法具有高效、特異、反應(yīng)條件溫和、降解過程易于控制、反應(yīng)產(chǎn)物易分離、環(huán)境污染少等優(yōu)點(diǎn)。因此，卡拉膠酶酶解卡拉膠將逐漸取代傳統(tǒng)的物理、化學(xué)等降解方法成為制備卡拉膠寡糖的最佳方法。
[0004]我國擁有遼闊的海域，海洋中豐富的海藻資源為生產(chǎn)研宄提供了充足海藻多糖。由于卡拉膠酶的主要來源是海洋微生物，海洋環(huán)境的特殊性導(dǎo)致了卡拉膠酶的穩(wěn)定性不好或者活力不高，限制了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用。有鑒于此，本發(fā)明人研宄和設(shè)計(jì)了一種食鹿角菜假交替單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)卡拉膠酶的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，本案由此產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種食鹿角菜假交替單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)卡拉膠酶的培養(yǎng)基，利用一株能降解卡拉膠的食鹿角菜假交替單胞菌ieroff1aas sp.) ASY5 (該菌種來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，保藏編號:CICC 23819)，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基后，可以有效提高食鹿角菜假交替單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)卡拉膠酶的單位產(chǎn)量。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供利用上述培養(yǎng)基進(jìn)行食鹿角菜假交替單胞菌發(fā)酵卡拉膠酶的方法，通過種子活化、搖瓶發(fā)酵、罐上發(fā)酵及中試放大發(fā)酵的逐級放大培養(yǎng)步驟，確定最佳的發(fā)酵條件，進(jìn)而提高最終發(fā)酵液中卡拉膠酶的單位產(chǎn)量。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案是:
一種所述食鹿角菜假交替單胞菌ASY5發(fā)酵生產(chǎn)卡拉膠酶的培養(yǎng)基，包括菌種活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基；
所述菌種活化培養(yǎng)基為:牛肉膏10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，瓊脂20 g/L，NaCl 21.1g/L，KCl 0.58 g/L，CaCl2 0.811 g/L，MgCl2.6Η20 3.6 g/L , NaHCO3 0.083 g/L，MgSO4* 7H20 2.625 g/L，調(diào) pH 到 7.3，121°C 滅菌 20 min ；
所述種子培養(yǎng)基為:牛肉膏10 g/L，胰蛋白胨10 g/L ,NaCl 21.1 g/L ,KCl 0.58 g/L ,CaCl2 0.811 g/L , MgCl2.6Η20 3.6 g/L , NaHCO3 0.083 g/L , MgSO4.7Η20 2.625 g/L，調(diào) pH 到 7.3，121°C 滅菌 20 min ；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:卡拉膠2.5 g/L，胰蛋白胨3.0 g/L，NaCl 30.0 g/L，KCl0.1 g/L，MgSO4.7H20 3.0 g/L，F(xiàn)eSO4.7Η20 0.0366 g/L，Na2HPO4.12H20 3.78 g/L，NaH2P04*2H201.3 g/L，CaCl2 0.2 g/L，121°C滅菌 20 min。
[0008]本發(fā)明還涉及所述食鹿角菜假交替單胞菌ASY5利用如上所述培養(yǎng)基生產(chǎn)卡拉膠酶的發(fā)酵方法，包括以下步驟:
種子的活化與制備:將上述食鹿角菜假交替單胞菌ASY5菌種接至菌種活化培養(yǎng)基中，20°C培養(yǎng)24 h，再接至裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，20°C培養(yǎng)24 h，獲得搖瓶種子液；
搖瓶發(fā)酵:搖瓶種子液接種至裝有適用于食鹿角菜假交替單胞菌ASY5產(chǎn)卡拉膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶之中，20°C培養(yǎng)72 h，獲得含有卡拉膠酶的發(fā)酵液；
罐上發(fā)酵:搖瓶種子液接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的7 L發(fā)酵罐中，20°C培養(yǎng)72 h，獲得含有卡拉膠酶的發(fā)酵液；
中試放大發(fā)酵:搖瓶種子液接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的20 L的發(fā)酵罐中，20°C培養(yǎng)72h，獲得含有卡拉膠酶的發(fā)酵液；或者搖瓶種子液接種至裝有種子培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中，20°C培養(yǎng)24h，獲得發(fā)酵罐種子液，再將發(fā)酵罐種子液接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的200 L發(fā)酵罐中，20°C培養(yǎng)72h，獲得含有卡拉膠酶的發(fā)酵液。
[0009]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述種子的活化與制備步驟，將_20°C保藏的甘油管菌種解凍后接于裝有菌種活化培養(yǎng)基的平板，20°C培養(yǎng)24 h，獲得活化的食鹿角菜假交替單胞菌ASY5菌種；然后從平板上挑取培養(yǎng)好的菌種于裝有40 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，200C，180 r/min發(fā)酵24 h，獲得搖瓶種子液。
[0010]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述搖瓶發(fā)酵，將培養(yǎng)好的搖瓶種子液以2%的接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，20°C，180 r/min發(fā)酵72 h。
[0011]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述罐上發(fā)酵，將培養(yǎng)好的搖瓶種子液按照2%的接種量接入裝有5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的7 L發(fā)酵罐中，20 °C，400 r/min發(fā)酵72 h。
[0012]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述中試放大發(fā)酵，將培養(yǎng)好的種子按照2%的接種量接入裝有10 L發(fā)酵培養(yǎng)基的20 L罐中，20°C，150 r/min發(fā)酵72 h。
[0013]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述中試放大發(fā)酵，將培養(yǎng)好的搖瓶種子液按照2%的接種量接入裝有5 L種子培養(yǎng)基的7 L罐中，20°C發(fā)酵24 h，獲得發(fā)酵罐種子液，再將發(fā)酵罐種子液按照2%的接種量接入裝有100 L發(fā)酵培養(yǎng)基的200 L罐中，20°C，100 r/min發(fā)酵72 h0
【附圖說明】
[0014]圖1食鹿角菜假交替單胞菌ASY5培養(yǎng)平板；
圖2食鹿角菜假交替單胞菌ASY5產(chǎn)卡拉膠酶的罐上發(fā)酵曲線；
圖3食鹿角菜假交替單胞菌ASY5產(chǎn)卡拉膠酶的20L罐上發(fā)酵曲線；
圖4食鹿角菜假交替單胞菌ASY5產(chǎn)卡拉膠酶的200L罐上發(fā)酵曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下列實(shí)施例中采用的檢測方法:
生物量的測定:均勾吸取1.0 ml發(fā)酵液，12000 r/min離心10 min，去掉上清液后用蒸餾水梯度稀釋至6倍，以蒸餾水作空白，600 nm波長測吸光值。
[0016]卡拉膠酶活力的測定:均勾取1.0mL發(fā)酵液，12000 r/min離心lOmin，準(zhǔn)確吸取0.25mL 上清液，用 50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH 7.5)稀釋 20 倍，取 50 μ? 稀釋液，添加550 μ?溶于50 mmol /L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH 7.5)的0.5%的卡拉膠(高溫溶解后保溫于60°C水浴中)，60°C溫浴20 min，加0.9 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5 min后冷卻，稀釋到5 mL，測520 nm處的吸光值，然后依據(jù)以半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算反應(yīng)液中還原糖的生成量，以檢測發(fā)酵液中卡拉膠酶的活力。以沸水浴滅活5 min的酶液作為對照。以上述條件下I min催化產(chǎn)生I μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。
[0017]實(shí)施例1:食鹿角菜假交替單胞菌ASY5的篩選
本發(fā)明首先在紅樹林土壤腐葉樣品中分離得到了一株能降解卡拉膠的食鹿角菜假交替單胞菌ASY5 (Pseudoalteromonas sp.ASY5)(保藏編號:CICC23819)，以卡拉膠為唯一碳源配制固體培養(yǎng)基，接種后于20°C培養(yǎng)48 h，平板上出現(xiàn)卡拉膠被降解后形成的水解圈或凹坑，如圖1所示。
[0018]實(shí)施例2:食鹿角菜假交替單胞菌ASY5的搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)卡拉膠酶
(1)將-20°C保藏的甘油管菌種解凍后接于裝有菌種活化培養(yǎng)基的平板，于20°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，獲得活化的食鹿角菜假交替單胞菌ASY5菌種。所述菌種活化培養(yǎng)基為:牛肉膏 10 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，瓊脂 20 g/L, NaCl 21.1 g/L，KCl 0.58 g/L，CaCl20.811 g/L，MgCl2.6Η20 3.6 g/L，NaHCO3 0.083 g/L，MgSO4* 7H20 2.625 g/L，調(diào) pH 到7.3。121°C 滅菌 20 min ；
(2)從平板上挑取培養(yǎng)好的菌種于裝有40mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，20°C，180r/min發(fā)酵24 h，獲得搖瓶種子液。所述種子培養(yǎng)基為:蛋白胨5 g/L，酵母膏I g/L，NaCl30 g/L, MgSO4*7H20 5 g/L, KCl I g/L, CaCl2 0.2 g/L, K2HPO4 0.1 g/L, FeSO4.7Η20 0.02g/L, pH 7.5，121°C滅菌 20 min ；
(3)將培養(yǎng)好的搖瓶種子液以2%的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，20°C，180 r/min發(fā)酵72 h，得到含卡拉膠酶的發(fā)酵液。所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:卡拉膠2.5 g/L，胰蛋白胨 3.0 g/L，NaCl 30.0 g/L，KCl 0.1 g/L，MgSO4.7Η20 3.0 g/L，F(xiàn)eSO4*7Η20 0.0366 g/L，Na2HPO4* 12Η20 3.78 g/L，NaH2P04*2H201.3 g/L，CaCl2 0.2 g/Lo 121°C滅菌 20 min。
[0019](4)均勾取1.0 mL含卡拉膠酶發(fā)酵液，12000 r/min離心lOmin，測定所得清液的卡拉膠酶活力最高為36.8 U/mL。
[0020]實(shí)施例3:食鹿角菜假交替單胞菌ASY5的罐上發(fā)酵生產(chǎn)卡拉膠酶
(1)將-20°C保藏的甘油管菌種解凍后接于裝有菌種活化培養(yǎng)基的平板，于20°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，獲得活化的食鹿角菜假交替單胞菌ASY5菌種。所述菌種活化培養(yǎng)基為:牛肉膏 10 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，瓊脂 20 g/L, NaCl 21.1 g/L，KCl 0.58 g/L，CaCl20.811 g/L，MgCl2.6Η20 3.6 g/L，NaHCO3 0.083 g/L，MgSO4* 7H20 2.625 g/L，調(diào) pH 到7.3。121°C 滅菌 20 min ；
(2)從平板上挑取培養(yǎng)好的菌種于裝有40mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，20°C，180r/min發(fā)酵24 h，獲得搖瓶種子液。所述種子培養(yǎng)基為:牛肉膏10 g/L，胰蛋白胨10 g/L,NaCl 21.1 g/L ,KCl 0.58 g/L，CaCl2 0.811 g/L , MgCl2.6Η20