一種基于dnah5基因的結(jié)腸癌診斷試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于癌癥相關(guān)基因檢測(cè)領(lǐng)域，更具體本發(fā)明以DNAH5基因在結(jié)腸癌組織 中表達(dá)量較正常組織明顯下調(diào)為基礎(chǔ)，涉及一種基于DNAH5基因的結(jié)腸癌診斷試劑盒及 DNAH5基因在制備結(jié)腸癌診斷試劑盒中的應(yīng)用，本發(fā)明也涉診斷結(jié)腸癌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)腸癌是大腸癌的一種，是國(guó)內(nèi)外常見的惡性腫瘤之一，在40-50歲年齡段發(fā)病 率最高，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。據(jù)世界流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌在北美、西歐、 澳大利亞、新西蘭等地的發(fā)病率最高，居內(nèi)臟腫瘤前二位，但在亞、非、拉美等地發(fā)病率則很 低。在我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率僅次于胃癌、食管癌，占據(jù)消化道腫瘤的第3位。近年來隨著人 民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。
[0003] 結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但病因?qū)W研宄已經(jīng)表明，絕大部分結(jié)腸癌的發(fā) 生是一個(gè)多步驟、多階段，環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的復(fù)雜過程。它的發(fā)生發(fā)展涉及多 個(gè)基因的改變，表現(xiàn)為多基因多步驟的協(xié)同累積以及相互作用。近些年，高通量測(cè)序技術(shù)的 產(chǎn)生和發(fā)展，對(duì)基因組學(xué)研宄帶來了革命性的變革，使得大規(guī)模、快速、高效檢測(cè)基因突變 成為可能，近年來已廣泛地應(yīng)用于檢測(cè)疾病相關(guān)的突變位點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外已應(yīng)用基因芯片及高 通量篩選等技術(shù)對(duì)結(jié)腸癌基因表達(dá)譜進(jìn)行了較多研宄。歸根結(jié)底結(jié)腸癌是一種基因病，是 體內(nèi)外環(huán)境相互作用的結(jié)果，它的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)基因的改變，導(dǎo)致某些基因表達(dá)量增 加或降低，如CD44V6的過度表達(dá)與消化道腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并保護(hù)了血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子（VEGF)的促內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而促進(jìn)了腫瘤血管生成和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移；VEGF誘導(dǎo)survivin 表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)的Survivin抑制了各種指向caspase的凋亡機(jī)制，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞逃 避凋亡。通過上述與結(jié)腸癌相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)，可以給結(jié)腸癌進(jìn)行早期診斷提供依據(jù)，制 備以相應(yīng)基因?yàn)榛A(chǔ)的結(jié)腸癌診斷試劑盒。
[0004] DNAH5 (dynein，axonemal，heavy chain 5)基因是參與纖毛或鞭毛運(yùn)動(dòng)，基于微管 的運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞定位等的基因，目前的研宄集中在該基因與肺部或纖毛運(yùn)動(dòng)障礙等慢性疾病 的相關(guān)性方面，而沒有關(guān)于該基因與結(jié)腸癌相關(guān)的研宄及介紹。
[0005] 本發(fā)明通過對(duì)正常組織與結(jié)腸癌組織的基因表達(dá)的測(cè)序分析，得出DNAH5基因在 結(jié)腸癌組織中的表達(dá)量較正常組織明顯下調(diào)，是影響結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因。進(jìn)一步 使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(QPCR)檢測(cè)臨床樣本中的DNAH5基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，可以對(duì)結(jié)腸癌 的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行探宄，該基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平可以為制備基于DNAH5基因的結(jié)腸癌診斷試劑 盒提供依據(jù)，還可以以該基因?yàn)榛A(chǔ)制備結(jié)腸癌診斷試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明通過對(duì)結(jié)腸癌與正常組織轉(zhuǎn)錄組表達(dá)進(jìn)行高通量測(cè)序分析和進(jìn)一步QPCR 驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)DNAH5基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與在正常組織相比明顯下調(diào)。通過檢測(cè)DNAH5 基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，可以判斷受試者是否患有結(jié)腸癌。
[0007] 本發(fā)明的目的在于提供DNAH5基因在制備基于DNAH5基因的結(jié)腸癌診斷試劑盒中 的用途及一種基于DNAH5基因的結(jié)腸癌診斷試劑盒。
[0008] 根據(jù)DNAH5基因的在結(jié)腸癌組織中轉(zhuǎn)錄水平較正常組織明顯下調(diào)，可以根據(jù)這一 特點(diǎn)，以DNAH5基因?yàn)榛A(chǔ)為制備基于DNAH5基因的結(jié)腸癌診斷試劑盒提供依據(jù)。DNAH5基 因在制備基于DNAH5基因的結(jié)腸癌診斷試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于所述診斷試劑盒包含 DNAH5基因熒光實(shí)時(shí)定量PCR的引物對(duì)，所述引物分別為：
[0009] 正向引物序列為 5' -GACCACCGAGGCTCATAAGCAGTT-3'，如 SEQ ID NO :1 所示；
[0010] 反向引物序列為 5' -GCAGGTCTTGGCTGACACCACTATA-3'，如 SEQ ID NO :2 所示。 [0011] 本發(fā)明的另一目的是提供一種基于DNAH5基因的結(jié)腸癌診斷試劑盒，所述試劑盒 包含DNAH5基因熒光實(shí)時(shí)定量PCR的引物對(duì)，引物對(duì)可以根據(jù)引物設(shè)計(jì)的常規(guī)設(shè)計(jì)原則設(shè) 計(jì)。優(yōu)選的實(shí)施方案中所述引物分別為：
[0012] 正向引物序列為 5' -GACCACCGAGGCTCATAAGCAGTT-3'，如 SEQ ID NO :1 所示；
[0013] 反向引物序列為 5' -GCAGGTCTTGGCTGACACCACTATA-3'，如 SEQ ID NO :2 所示。
[0014] 所述診斷試劑盒還包含擴(kuò)增管家基因 GAPDH引物對(duì)，引物對(duì)可以根據(jù)引物設(shè)計(jì)的 常規(guī)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)。優(yōu)選的實(shí)施方案中所述引物分別為：
[0015] 正向引物序列為 5' -TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'，如 SEQ ID NO :3 所示；
[0016] 反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3' 如 SEQ ID NO :4 所示。
[0017] 所述診斷試劑盒還包含SYBR Green PCR反應(yīng)體系，所述SYBR Green PCR反應(yīng)體 系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
[0018] 上述技術(shù)方案中，所述PCR緩沖液為本領(lǐng)域的公知現(xiàn)有技術(shù)，優(yōu)選地，PCR緩沖液 包含：20mMKCl，2. 5mMMgCl2,200mM (NH4)2SO40
[0019] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體 系，該逆轉(zhuǎn)錄體系包含：T重復(fù)寡核苷酸Oligo (dT)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶 抑制劑、dNTPs。
[0020] 優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含：250mM PH8. 3 的 Tris-HCL，370mM 的 KCL，15mM 的 MgCl2, 50mM 的 DTT。
[0021] RNA酶抑制劑可選用本領(lǐng)域常用的RNA酶抑制劑，優(yōu)選為大腸桿菌表達(dá)的非競(jìng)爭(zhēng) 性抑制RNA酶的重組蛋白酶。
[0022] 在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含RNA提取試劑， RNA酶提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75 %乙醇。
[0023] 本發(fā)明的診斷試劑盒保存于_20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0024] 本發(fā)明還提供了診斷結(jié)腸癌的方法，所述方法包括：
[0025] (1)利用RNA提取試劑提取樣本總RNA ;
[0026] (2)將步驟⑴獲得的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ;
[0027] (3)在熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上將DNAH5基因和管家基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)；
[0028] (4)通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Δ Λ CT法進(jìn)行相對(duì)定量；
[0029] (5) DNAH5基因表達(dá)下調(diào)，表明研宄對(duì)象為結(jié)腸癌患者。
[0030] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果在于：（1)本發(fā)明首次公開了 DNAH5基因與結(jié)腸癌相關(guān) 性，可以以DNAH5基因?yàn)榛A(chǔ)在制備診斷試劑盒方面提供依據(jù)。（2)該發(fā)明提供的診斷試 劑盒可以通過檢測(cè)基因表達(dá)情況診斷結(jié)腸癌的存在與否，利用該試劑盒檢測(cè)結(jié)腸癌更加靈 敏，有利于疾病早期的診斷。
【附圖說明】：
[0031] 圖1表示熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定在正常組織和結(jié)腸癌組織中DNAH5基因 mRNA的 相對(duì)表達(dá)量。
[0032] 具體的實(shí)施方式：
[0033] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，以下所述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法 如無特殊說明，均為常規(guī)方法。以下所