Wwp1基因在制備骨肉瘤診斷產(chǎn)品和治療藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及WffPl基因的新用途，具體涉及WffPl基因在制備診 斷骨肉瘤產(chǎn)品和制備治療骨肉瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨肉瘤是來源于間葉組織的惡性腫瘤，其主要致病特征為體內(nèi)增殖的腫瘤細(xì)胞直 接形成未成熟骨或骨樣組織。是一種人類骨骼系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。典型的骨肉 瘤是一種罕見的（占全部惡性腫瘤的0. 2% )高致癌惡性腫瘤，其發(fā)病率約每年每一百萬 人里有三例。骨肉瘤主要出現(xiàn)在較長的骨骼以及少部分的軟組織。其主要發(fā)病人群集中在 10?20歲青少年，具有發(fā)病率高，早期轉(zhuǎn)移率高，治愈生存率低等特點(diǎn)。X-射線，斷層攝影 技術(shù)，核磁共振，血管造影技術(shù)以及動態(tài)骨閃爍攝影技術(shù)等廣泛應(yīng)用于該病的診斷、腫瘤發(fā) 生的程度及手術(shù)類型判斷等等。但是利用上述臨床手段進(jìn)行骨肉瘤的診斷，常常導(dǎo)致患者 的病情延誤，錯過最佳治療時期。因此尋找一種骨肉瘤早期診斷標(biāo)志物是亟待解決的問題。
[0003] 高通量轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-sep)是在轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)行深度測序的一項(xiàng)技術(shù)，測 序技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組分析中的應(yīng)用主要集中在基因表達(dá)譜的構(gòu)建，新基因的發(fā)現(xiàn)、小分子非編 碼RNA表達(dá)譜的構(gòu)建和新小分子RNA基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)編碼基因注釋、以及如fusion transcript等轉(zhuǎn)錄組研宄上。數(shù)據(jù)在最初的處理上是大體是相似的，接下來針對不同的研 宄目的可以選用不同的生物信息學(xué)軟件進(jìn)行計(jì)算。
[0004] 利用大規(guī)模測序技術(shù)直接對由mRNA反轉(zhuǎn)錄成的CDNA序列進(jìn)行測序，產(chǎn)生數(shù)以 千萬計(jì)的reads數(shù)量，從而使得一段特殊的基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄水平可以直接通過比對到該 基因組區(qū)域的reads數(shù)來衡量。該技術(shù)常用來構(gòu)建某一特定組織或細(xì)胞的基因表達(dá)譜，通 過對正常組織和病變組織進(jìn)行基因表達(dá)譜的分析，得到在兩種組織中差異表達(dá)的基因，一 方面為研宄疾病的發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制提供新的思路，另一方面為疾病的診斷和治療提 供新的診斷標(biāo)志物或藥物靶點(diǎn)。
[0005] 利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序篩選與骨肉瘤密切相關(guān)的基因，不僅有利于研宄骨肉瘤的 發(fā)生和發(fā)展的病理機(jī)制，而且能為診斷和治療骨肉瘤提供新的診斷標(biāo)志物或新的藥物靶 點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明利用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)WffPl基因在骨肉瘤組織中的表達(dá)與在正常骨組 織中的表達(dá)存在差異，與正常骨組織相比，WffPl基因在骨肉瘤組織中表達(dá)上調(diào)，通過檢測 WffPl基因的表達(dá)情況，就可以判斷受試者是否患有骨肉瘤。
[0007] 本發(fā)明的目的之一在于提供WffPl基因在制備診斷骨肉瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的之二在于提供WffPl基因在制備治療骨肉瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明提供了一種診斷骨肉瘤的產(chǎn)品，所述診斷骨肉瘤的產(chǎn)品通過檢測受試者成 骨細(xì)胞中WffPl基因的表達(dá)來判斷受試者是否患有骨肉瘤。
[0011] 進(jìn)一步，所述診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括：用RT-PCR、實(shí)時定量PCR、免疫檢測、原位雜 交或基因芯片診斷骨肉瘤的產(chǎn)品。所述用RT-PCR診斷骨肉瘤的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò) 增WffPl基因的引物；所述用實(shí)時定量PCR診斷骨肉瘤的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增WffPl 基因的引物；所述用免疫檢測診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括：與WWPl蛋白特異性結(jié)合的抗體；所 述用原位雜交診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括：與WWPl基因的核酸序列雜交的探針；所述用基因芯 片診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括：與WWPl基因的核酸序列雜交的探針。
[0012] 使用RT-PCR診斷骨肉瘤產(chǎn)品中包含的特異擴(kuò)增WffPl基因的引物是利用 Primerf.O引物設(shè)計(jì)軟件或者其他常用的引物在線軟件設(shè)計(jì)而成。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來 說，根據(jù)已知基因序列設(shè)計(jì)出能夠用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增引物是不需要付出創(chuàng)造性勞動 即可實(shí)現(xiàn)的。因此本發(fā)明的RT-PCR用的特異擴(kuò)增WffPl基因的引物是指所有能夠在RT-PCR 實(shí)驗(yàn)中成功擴(kuò)增WWPl基因的引物序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)的 WWPl基因擴(kuò)增引物序列如下：正向引物：5'-CCAGAACAACAACGTGGCAG-3'（SEQ ID ΝΟ:1);反 向引物：5' -CTGCCGGGACACATTGATCT-3'（SEQ ID NO :2)。
[0013] 所述用實(shí)時定量PCR診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包含的特異擴(kuò)增WffPl基因的引物是根 據(jù)常用的QPCR引物在線軟件設(shè)計(jì)而成。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，根據(jù)已知基因序列 設(shè)計(jì)出能夠用于QPCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增引物是不需要付出創(chuàng)造性勞動即可實(shí)現(xiàn)的。因此本發(fā) 明的實(shí)時定量PCR用的特異擴(kuò)增WffPl基因的引物是指所有能夠在QPCR實(shí)驗(yàn)中成功擴(kuò) 增WffPl基因的引物序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，用于QPCR實(shí)驗(yàn)的WffPl基因擴(kuò) 增引物序列如下：正向引物：5'-AGAAGGACTTGATTATGGT-3'（SEQ ID NO :3);反向引物： 5?-TAATGGTTGATGCTGGAT-3, (SEQ ID NO ：4) 〇
[0014] 與WffPl基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它 衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合， 任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針 的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度 對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一 般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自 身互補(bǔ)序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
[0015] 與WffPl蛋白特異性結(jié)合的抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。上述抗 體可以從商業(yè)途徑獲取，也可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備。例如，將純化的人 WWPl蛋白或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人WWPl蛋白或 它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)制 備。WffPl蛋白的抗體包括可以阻抑WffPl蛋白功能的抗體，也可以是不影響人WffPl蛋白功 能的抗體。每一類抗體都可以通過對人WffPl蛋白的片斷或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人WffPl 蛋白產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的WffPI 蛋白結(jié)合的抗體，可以利用在原核細(xì)胞例如E. COli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。 與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化WffPI蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細(xì)胞 如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。
[0016] 本發(fā)明提供了 WffPl基因在制備診斷骨肉瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0017] 所述診斷骨肉瘤的產(chǎn)品通過檢測受試者成骨細(xì)胞中WffPl基因的表達(dá)來判斷受試 者是否患有骨肉瘤。所述診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括：用RT-PCR、實(shí)時定量PCR、免疫檢測、原 位雜交或基因芯片診斷骨肉瘤的產(chǎn)品。所述用RT-PCR診斷骨肉瘤的產(chǎn)品至少包括一對特 異擴(kuò)增WffPl基因的引物；所述用實(shí)時定量PCR診斷骨肉瘤的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增 WWPl基因的引物；所述用免疫檢測診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括：與WWPl蛋白特異性結(jié)合的抗 體；所述用原位雜交診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括：與WWPl基因的核酸序列雜交的探針；所述用 基因芯片診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括：與WWPl基因的核酸序列雜交的探針。
[0018] 使用RT-PCR診斷骨肉瘤產(chǎn)品中包含的特異擴(kuò)增WffPl基因的引物是利用 Primerf.O引物設(shè)計(jì)軟件或者其他常用的引物在線軟件設(shè)計(jì)而成。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來 說，根據(jù)已知基因序列設(shè)計(jì)出能夠用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增引物是不需要付出創(chuàng)造性勞動 即可實(shí)現(xiàn)的。因此本發(fā)明的RT-PCR用的特異擴(kuò)增WffPl基因的引物是指所有能夠在RT-PCR 實(shí)驗(yàn)中成功擴(kuò)增WWPl基因的引物序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)的 WWPl基因擴(kuò)增引物序列如下：正向引物：5'-CCAGAACAACAACGTGGCAG-3'（SEQ ID ΝΟ:1);反 向引物：5' -CTGCCGGGACACATTGATCT-3'（SEQ ID NO :2)。
[0019] 所述用實(shí)時定量PCR診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包含的特異擴(kuò)增WffPl基因的引物是根 據(jù)常用的QPCR引物在線軟件設(shè)計(jì)而成。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，根據(jù)已知基因序列 設(shè)計(jì)出能夠用于QPCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增引物是不需要付出創(chuàng)造性勞動即可實(shí)現(xiàn)的。因此本發(fā) 明的實(shí)時定量PCR用的特異擴(kuò)增WffPl基因的引物是指所有能夠在QPCR實(shí)驗(yàn)中成功擴(kuò) 增WffPl基因的引物序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，用于QPCR實(shí)驗(yàn)的WffPl基因擴(kuò) 增引物序列如下：正向引物：5'-AGAAGGACTTGATTATGGT-3'（SEQ ID NO :3);反向引物： 5?-TAATGGTTGATGCTGGAT-3, (SEQ ID NO ：4) 〇
[0020] 與WffPl基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它 衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合， 任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針 的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度 對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一 般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自 身互補(bǔ)序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
[0021] 與WffPl蛋白特異性結(jié)合的抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。上述抗 體可以從商業(yè)途徑獲取，也可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備。例如，將純化的人 WWPl蛋白或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人WWPl蛋白或 它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)制 備。WffPl蛋白的抗體包括可以阻抑WffPl蛋白功能的抗體，也可以是不影響人WffPl蛋白功 能的抗體。每一類抗體都可以通過對人WffPl蛋白的片斷或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人WffPl 蛋白產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的WffPI 蛋白結(jié)合的抗體，可以利用在原核細(xì)胞例如E. COli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。 與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化WffPI蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細(xì)胞 如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。
[0022] 本發(fā)明的所述診斷骨肉瘤的產(chǎn)品選自以下組：試劑盒、芯片、濾紙。上述試劑盒可 以是檢測基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，如RT-PCR試劑盒、QPCR試劑盒，也可以是檢測基因表達(dá) 水平的試劑盒，如ELISA試劑盒。上述芯片可以是基因芯片或是蛋白芯片，其能夠檢測目的 基因的表達(dá)水平。
[0023] 所述RT-PCR試劑盒除包含特異擴(kuò)增WffPl基因的引物之外，還可包含PCR緩沖液、 dNTPs、MgCl2、Tap DNA聚合酶。所述RT-PCR試劑盒還可包含RNA提取試劑，RNA酶提取試 劑包含Trizol、氯仿、異