一種Arm-PCR擴(kuò)增子長(zhǎng)度可調(diào)的引物設(shè)計(jì)新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種Arm-PCR擴(kuò)增子長(zhǎng)度可調(diào)的引物設(shè)計(jì)新方法，該方法通過(guò)改變PCR擴(kuò)增子的長(zhǎng)度有利于Arm-PCR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]擴(kuò)增子挺救多重PCR(ampliconrescue multiplex PCR，以下簡(jiǎn)稱(chēng)Arm-PCR)技術(shù)，其原理是針對(duì)多重PCR體系中的每個(gè)靶序列，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)套式引物，使其可以形成4種擴(kuò)增引物組合；由于每個(gè)靶序列都有4種可能的擴(kuò)增模式，從而使得尋找不同靶序列最佳通用的擴(kuò)增條件變得簡(jiǎn)單可行，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)多種靶基因的高特異性、高靈敏度的同步擴(kuò)增。
[0003]毛細(xì)管電泳技術(shù)是一類(lèi)以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)樣品中各組分之間迀移速度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類(lèi)液相分離技術(shù)，該技術(shù)迅速發(fā)展于20世紀(jì)80年代中后期，它實(shí)際上包含電泳技術(shù)和色譜技術(shù)及其交叉內(nèi)容，是分析科學(xué)中繼高效液相色譜之后的又一重大進(jìn)展，它使分析科學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平，并使細(xì)胞分析，乃至單分子分析成為可能。通過(guò)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)可對(duì)不同片段長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離和識(shí)別，同時(shí)，根據(jù)峰面積的大小還可對(duì)不同產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種Arm-PCR擴(kuò)增子長(zhǎng)度可調(diào)的引物設(shè)計(jì)新方法，通過(guò)在Arm-PCR的內(nèi)向上下游引物的接頭序列后加T連接子，進(jìn)而改變Arm-PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
[0005]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種Arm-PCR擴(kuò)增子長(zhǎng)度可調(diào)的引物設(shè)計(jì)新方法，其通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn):
a、通過(guò)icubate2.0在線軟件設(shè)計(jì)Arm-PCR引物；
b、在Arm-PCR內(nèi)向上下游引物的接頭序列后加T連接子；
c、Arm-PCR反應(yīng)體系的配制；
d、Arm-PCR反應(yīng)條件的設(shè)定與運(yùn)行；
e、Arm-PCR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)。
[0006]步驟b中在Arm-PCR第一步擴(kuò)增反應(yīng)所需要的內(nèi)向上下游引物的接頭序列后各加I個(gè)T、2個(gè)Τ、3個(gè)Τ、4個(gè)T和5個(gè)T連接子，從而使PCR擴(kuò)增子的長(zhǎng)度改變2bp、4bp、6bp、8bp 和 1bp。
[0007]步驟e中Arm-PCR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)為:在Arm-PCR第二步擴(kuò)增所需要的超級(jí)引物的5’端加上熒光標(biāo)記才能進(jìn)行后續(xù)的毛細(xì)管電泳檢測(cè)。
[0008]本發(fā)明現(xiàn)以轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2 NOS終止子為例，其引物組包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向內(nèi)引物F1、反向內(nèi)引物Ri，用于Arm-PCR的第一步擴(kuò)增；5’端ROX標(biāo)記的超級(jí)上游引物Fs和下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步擴(kuò)增，以下6組引物都是在第一組內(nèi)向上下游引物Fi和Ri的接頭序列后加T連接子，其接頭序列與超級(jí)引物的序列相同，核苷酸序列分別如下所示:
1,Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT
F1: GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACAGATTGAATCCTGTTGCCR1: CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATTRo: CTAGTAACATAGATGACACCG
2,Fo: CAAACATTTGGCAATAAAGTTT
F1: GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTAGATTGAATCCTGTTGCCR1: CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATTRo: CTAGTAACATAGATGACACCG
3,Fo: CAAACATTTGGCAATAAAGTTT
F1: GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTTAGATTGAATCCTGTTGCCR1:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATTRo: CTAGTAACATAGATGACACCG
4,Fo: CAAACATTTGGCAATAAAGTTT
F1: GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTTTAGATTGAATCCTGTTGCCR1:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATTRo: CTAGTAACATAGATGACACCG
5,Fo: CAAACATTTGGCAATAAAGTTT
F1: GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTTTTAGATTGAATCCTGTTGCCR1:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATTRo: CTAGTAACATAGATGACACCG
6,Fo: CAAACATTTGGCAATAAAGTTT
F1: GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTTTTTAGATTGAATCCTGTTGCCR1:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTTTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATTRo: CTAGTAACATAGATGACACCG超級(jí)上游引物 Fs:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC ；
超級(jí)下游引物 Fs: CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT ；
利用Arm-PCR檢測(cè)引物組進(jìn)行Arm-PCR反應(yīng)，包括如下步驟:
(1)以轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2 NOS終止子的質(zhì)粒為模板；
(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng):在PCR管中配制第一步反應(yīng)體系:引物液2.5μ1，反應(yīng)液Mix12.5 μ 1，GTS 40-3-2 NOS終止子質(zhì)粒2?5 μ 1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ I ;設(shè)置空白對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用雙蒸水代替模板；將配制好的PCR管混勻后離心，并于95°C 15min;94°C 30s, 60°C 90s, 72°C 60s，15 個(gè)循環(huán)；94°C 15s, 70°C 90s，6 個(gè)循環(huán)；60°C延伸 30min，最后4°C保存；第二步PCR反應(yīng)體系為:超級(jí)引物液I μ 1，反應(yīng)液Mix 12.5μ1，第一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物I?2 μ 1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ I ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于950C 15min ；94°C 30s, 60°C 90s, 72°C 60s，30 個(gè)循環(huán)；60°C延伸 30min，最后 4°C保存；
(3)結(jié)果判斷:通過(guò)毛細(xì)管電泳檢測(cè)Arm-PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:icubate 2.0開(kāi)放平臺(tái)是網(wǎng)上的免費(fèi)多重PCR試劑設(shè)計(jì)軟件，由于icubate 2.0軟件設(shè)計(jì)出來(lái)的Arm-PCR引物擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物長(zhǎng)度相近，而毛細(xì)管電泳在檢測(cè)時(shí)會(huì)有2-3bp堿基的滑移現(xiàn)象，這種情況會(huì)導(dǎo)致結(jié)果判定不準(zhǔn)確，所以在這種基礎(chǔ)上本發(fā)明通過(guò)在Arm-PCR的內(nèi)向上下游引物的接頭序列后加T連接子，從而改變Arm-PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1 GTS 40-3-2 NOS終止子的Arm-PCR毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果圖；
圖2是本發(fā)明實(shí)施例1 GTS 40-3-2 NOS終止子內(nèi)向上下游引物的接頭序列后各加I個(gè)T連接子的Arm-PCR毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果圖；
圖3是本發(fā)明實(shí)施例1 GTS 40-3-2 NOS終止子內(nèi)向上下游引物的接頭序列后各加2個(gè)T連接子的Arm-PCR毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果圖；
圖4是本發(fā)明實(shí)施例1 GTS 40-3-2 NOS終止子內(nèi)向上下游引物的接頭序列后各加3個(gè)T連接子的Arm-PCR毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果圖；
圖5是本發(fā)明實(shí)施例1 GTS 40-3-2 NOS終止子內(nèi)向上下游引物的接頭序列后各加4個(gè)T連接子的Arm-PCR毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果圖；
圖6是本發(fā)明實(shí)施例1 GTS 40-3-2 NOS終止子內(nèi)向上下游引物的接頭序列后各加5個(gè)T連接子的Arm-PCR毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果圖；
圖7為空白對(duì)照組的毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0011]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0012]實(shí)施例1: 一種Arm-PCR擴(kuò)增子長(zhǎng)度可調(diào)的引物設(shè)計(jì)新方法，其通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn):
a、通過(guò)icubate2.0在線軟件設(shè)計(jì)Arm-PCR引物；
b、在Arm-PCR內(nèi)向上下游引物的接頭序列后加T連接子；
c、Arm-PCR反應(yīng)體系的配制；
d、Arm-PCR反應(yīng)條件的設(shè)定與運(yùn)行；
e、Arm-PCR產(chǎn)物的毛