改變代謝活性的酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及突變型醇脫氫酶、包含其的微生物以及通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生一種或多 種產(chǎn)物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)醇（例如乙醇或丁醇）是眾所周知的并且?guī)讉€世紀(jì)以來已經(jīng) 被用在工業(yè)上。從歷史上看，乙醇發(fā)酵是最大的過程。丙酮-丁醇-乙醇（ABE)發(fā)酵被認(rèn)為 是第二大發(fā)酵過程（Duerre P:Production of solvents. In:Handbook on Clostridia, CRC Press, 2005:671-696)，并且目前在例如中國的這些國家中的生產(chǎn)能力超過了 100萬 噸（Ni Y and Sun Z:Recent progress on industrial fermentative production of acetone-butanol-ethanol by Clostridium acetobutylicum in China. Appl. Microbiol. Biotechnol. ,2009,83:415-423)。丁醇經(jīng)常被用作溶劑或生物燃料，而丙酮被認(rèn)為是不 需要的副產(chǎn)物（Duerre P:Production of solvents. In:Handbook on Clostridia, CRC Press, 2005:671-696)。已知拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii)的一些分離株由于 存在仲醇脫氫酶而產(chǎn)生異丙醇而非丙酮（George HA, Johnson JL，Moore WEC, Holdeman LV,Chen JS:Acetone, isopropanol, and butanol production by Clostridium beijerinckii(syn. Clostridium butylicum)and Clostridium aurantibutyricum. Appl Environ Microbiol 45:1160-1163)。異丙醇具有和丁醇類似的特性且其比丙酮更有益。但 是，這種還原不是非常有效，并且相應(yīng)的拜氏梭菌菌株不能產(chǎn)生良好的效價且不被認(rèn)為是 有用的生產(chǎn)菌株。
[0003] 近來，已經(jīng)將丙酮丁醇梭菌（C. acetobutylicum)進(jìn)行代謝改造用于使用來自拜氏 梭菌的仲醇脫氫酶產(chǎn)生異丙醇（Leeet al，2012:Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum ATCC824for isopropanol-butanol-ethanol fermentation, Appl. Environ. Microbiol. 78:1416-1423)，但是需要高效的醇脫氫酶來優(yōu)化該過程。
[0004] ABE發(fā)酵的挑戰(zhàn)在于所有已知的生物都依賴于基于糖或淀粉的底物。很多適用于 產(chǎn)生化學(xué)產(chǎn)物（例如丙酮和異丙醇）的碳水化合物原料的成本受它們作為人類食物或動物 飼料的價值的影響，同時用于所述生產(chǎn)的產(chǎn)淀粉或蔗糖作物的栽培并非在所有地理條件下 都是經(jīng)濟(jì)上可持續(xù)的。因此，開發(fā)將更低成本和/或更豐富的碳源轉(zhuǎn)化成有用的化學(xué)產(chǎn)物 (例如丙酮和異丙醇）的技術(shù)是非常有益的。
[0005] CO是有機(jī)材料（例如煤炭或油和油衍生產(chǎn)物）不完全燃燒的主要的免費(fèi)的、 富含能量的副產(chǎn)物。例如，據(jù)報道，澳大利亞的鋼鐵工業(yè)每年生產(chǎn)并釋放超過50萬 噸CO到大氣中。產(chǎn)乙酸的生物（例如緊密相關(guān)的微生物自產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)、楊氏梭菌（C. ljungdahlii)和拉氏梭菌（C. ragsdalei))能夠以 含CO或含co2/h2的氣體作為唯一能源或碳源進(jìn)行化能自養(yǎng)生長，并且能夠合成產(chǎn)物例 如乙酸鹽、乙醇或2, 3-丁二醇，但是不能合成丙酮或異丙醇（Munasinghe PC, Khanal SK:Biomass-derived syngas fermentation into biofuels:Opportunities and challenges. Bioresource Technol 2010,5013-22)。
[0006] 最近，一項研究報道了拉氏梭菌（梭菌屬菌株P(guān)ll)在IOOL中試規(guī)模發(fā)酵 罐中從柳枝稷（switchgrass)來源的合成氣產(chǎn)生了異丙醇（Kundiyana DK, Huhnke RL, Wilkins MR:Syngas fermentation in a 100-L pilot scale fermentor:Design and process considerations. J Biosci Bioeng 2010,109:492-498)。但是，來自所述 同一實(shí)驗室的相關(guān)研究顯示，這是由所使用的合成氣中的污染引起的，因為所述合成氣通 過了含有 20% 丙酮的洗漆混合物（Ramachandriya KD:Effect of biomass generated producer gas, methane and physical parameters on producer gas fermentations by Clostridium strain Pll. Masters thesis, Oklahoma State University 2009 ； Ramachandriya KD, Wilkins MR, Delorme MJM, Zhu X, Kundiyana DK, Atiyeh HK, Huhnke RL:Reduction of acetone to isopropanol using producer gas fermenting microbes. Biofuels Environ Biotechnol, 2011, epub)。但是，作者確認(rèn)拉氏梭菌（梭菌屬菌株P(guān)ll) 可將丙酮還原為異丙醇并且推測存在仲醇脫氫酶，但沒有找到任何證據(jù)。
[0007] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的一種或多種缺陷，或者至少為公眾提供有用的選 擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明人已經(jīng)在自產(chǎn)乙醇梭菌中鑒定出新的伯醇：仲醇脫氫酶--該酶被用于例 如從CO產(chǎn)生異丙醇和/或一種或多種其他產(chǎn)物或用于將丙酮-丁醇-乙醇（ABE)發(fā)酵升 級為異丙醇-丙醇-乙醇（IBE)發(fā)酵或用于將MEK轉(zhuǎn)化成2-丁醇，并且已經(jīng)通過定點(diǎn)誘變 對該酶的特性（例如底物和/或輔因子特異性）進(jìn)行了優(yōu)化。
[0009] 在本發(fā)明的一個方面，提供了對至少一種第一底物比對至少一種第二底物具有更 強(qiáng)的特異性的醇脫氫酶，其中所述至少一種第一底物和所述至少一種第二底物選自：
[0010] 所述第一底物是丙酮且所述第二底物是MEK ;
[0011] 所述第一底物是丙酮且所述第二底物是乙醛；
[0012] 所述第一底物是丙酮且所述第二底物是乙偶姻；
[0013] 所述第一底物是MEK且所述第二底物是乙醛；
[0014] 所述第一底物是MEK且所述第二底物是乙偶姻；
[0015] 所述第一底物是乙偶姻且所述第二底物是丙酮；
[0016] 所述第一底物是乙偶姻且所述第二底物是MEK ;
[0017] 所述第一底物是乙偶姻且所述第二底物是乙醛；
[0018] 所述第一底物是乙醛且所述第二底物是丙酮；
[0019] 所述第一底物是乙醛且所述第二底物是乙偶姻；和
[0020] 所述第一底物是乙醛且所述第二底物是MEK ;并且
[0021] 其中和相應(yīng)的野生型醇脫氫酶相比，所述醇脫氫酶包含至少一個或多個突變。
[0022] 在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶對一種、兩種或三種第一底物比對兩種或三種 第二底物具有增強(qiáng)的特異性。在另一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶對兩種或三種第一底物 比對一種、兩種或三種第二底物具有增強(qiáng)的特異性。
[0023] 在另一方面，本發(fā)明提供了對NADH輔因子比對NADPH輔因子具有增強(qiáng)的特異性的 醇脫氫酶，其中和相應(yīng)的野生型醇脫氫酶相比，所述醇脫氫酶包含至少一個或多個突變。
[0024] 在另一方面，本發(fā)明提供了使用NADH作為輔因子的醇脫氫酶，其中和相應(yīng)的使用 NADPH作為輔因子的野生型醇脫氫酶相比，所述醇脫氫酶包含至少一個或多個突變。
[0025] 在一個具體實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶對丙酮比對MEK和/或乙醛和/或乙偶姻 具有增強(qiáng)的特異性。
[0026] 在一個具體實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶對MEK比對丙酮和/或乙醛和/或乙偶姻 具有增強(qiáng)的特異性。
[0027] 在一個具體實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶對乙醛比對丙酮和/或MEK和/或乙偶姻 具有增強(qiáng)的特異性。
[0028] 在一個具體實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶對乙偶姻比對丙酮和/或MEK和/或乙醛 具有增強(qiáng)的特異性。
[0029] 在一個具體實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶基本沒有使用乙偶姻作為底物的能力。在 一個具體實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶基本沒有使用乙偶姻作為底物的能力，但是能夠使用 丙酮、MEK和/或乙醛作為底物。
[0030] 在一個實(shí)施方案中，所述至少一個突變是在對應(yīng)于SEQ ID 36的醇脫氫酶序列的 位置Glyl98、Serl99、Arg200、Pro201和Tyr218的氨基酸中的一個或其組合上的氨基酸置 換。
[0031] 在一個實(shí)施方案中，和所對應(yīng)的野生型醇脫氫酶相比，所述醇脫氫酶包含一個或 多個以下突變：Glyl98Asp、Glyl98Ile、Glyl98Leu、Glyl98Val、Serl99Asp、Serl99Glu、 Serl99Leu、Serl99Val、Arg200Glu、Pro201Asp、Pro201Glu、Tyr218Ala 和 Tyr218Phe。
[0032] 在另一個實(shí)施方案中，和所對應(yīng)的野生型醇脫氫酶相比，所述醇脫氫酶包含以下 突變中的一個：Tyr218Gly、Tyr218Ser 或 Tyr218Val。
[0033] 在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含Serl99Asp置換。在一個實(shí)施方案中，所述 醇脫氫酶包含Serl99Glu置換。
[0034] 在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含以下置換的組合：Glyl98Asp、Serl99Val、 Pr〇201Glu。在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含以下置換的組合：Glyl98ASp、S erl99Leu 和Pr〇201Glu。在另一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含以下置換的組合：Glyl98Asp、 Serl99Val、Pro201Glu和Tyr218Ala。在另一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含以下置 換的組合：Glyl98Asp、Serl99Val、Pro201Glu和Tyr218Phe。在另一個實(shí)施方案中，所述 醇脫氫酶包含以下置換的組合：Glyl98Asp、Serl99Val、Pro201Glu和Tyr218Gly。在另 一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含以下置換的組合：Glyl98Asp、Serl99Val、Pr 〇201Glu 和Tyr218Ser。在另一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含以下置換的組合：Glyl98Asp、 Serl99Val、Pro201Glu 和 Tyr218Val。
[0035] 在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含Serl99Asp置換并且1)對丙酮比對MEK和 /或乙偶姻具有增強(qiáng)的底物特異性。在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含Serl99A Sp置換 并且對丙酮比對MEK和乙偶姻具有增強(qiáng)的底物特異性。
[0036] 在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含Ser 199G1U置換并且1)對丙酮比對MEK、 乙醛和/或乙偶姻；和/或2)對MEK比對乙醛和/或乙偶姻具有增強(qiáng)的底物特異性。在一 個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含Serl99Glu置換并且1)對丙酮比對MEK和乙醛以及乙偶 姻具有增強(qiáng)的底物特異性。在另一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含Serl99Glu置換并且 對MEK比對乙醛和乙偶姻具有增強(qiáng)的底物特異性。在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含 Serl99Glu置換并且1)對丙酮比對MEK、乙醛以及乙偶姻；和2)對MEK比對乙醛和乙偶姻 具有增強(qiáng)的底物特異性。
[0037] 在另一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含以下置換的組合：Glyl98Asp、Serl99Val 和Pro201Glu，并且1)對丙酮比對MEK;和/或2)對乙醛比對MEK、丙酮和/或乙偶姻；和 /或3)對乙偶姻比對丙酮和/或MEK具有增強(qiáng)的底物特異性。在一個實(shí)施方案中，包含所 述置換組合的醇脫氫酶對乙醛比對MEK、丙酮以及乙偶姻具有增強(qiáng)的底物特異性。在一個 實(shí)施方案中，包含所述置換組合的醇脫氫酶對乙偶姻比對丙酮和MEK具有增強(qiáng)的底物特異 性。在另一個實(shí)施方案中，包含所述置換組合的醇脫氫酶1)對丙酮比對MEK ;和2)對乙醛 比對MEK、丙酮以及乙偶姻；和3)對乙偶姻比對丙酮和MEK具有增強(qiáng)的底物特異性。
[0038] 在另一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含以下置換的組合：Glyl98Asp、 Serl99Val、Pro201Glu和Tyr218Ala，并且1)對丙酮比對MEK、乙醛和/或乙偶姻；和/或 2)對MEK比對乙醛和/或乙偶姻；和/或3)對乙偶姻比對乙醛具有增強(qiáng)的底物特異性。在 一個實(shí)施方案中，包含所述置換組合的醇脫氫酶對丙酮比對MEK、乙醛以及乙偶姻具有增強(qiáng) 的底物特異性。在一個實(shí)施方案中，包含所述置換組合的醇脫氫酶對MEK比對乙醛和乙偶 姻具有增強(qiáng)的底物特異性。在另一個實(shí)施方案中，包含所述置換組合的醇脫氫酶1)對丙酮 比對MEK、乙醛以及乙偶姻；和2)對MEK比對乙醛和乙偶姻；和3)對乙偶姻比對乙醛具有 增強(qiáng)的底物特異性。
[0039] 在另一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含以下置換的組合：Glyl98Asp、 Serl99Val、Pro201Glu和Tyr218Phe，并且1)對丙酮比對MEK、乙醛和/或乙偶姻；和/或 對MEK比對乙醛和/或乙偶姻；和/或3)對乙醛比對乙偶姻具有增強(qiáng)的底物特異性。在一 個實(shí)施方案中，包含所述置換組合的醇脫氫酶對丙酮比對MEK、乙醛以及乙偶姻具有增強(qiáng)的 底物特異性。在一個實(shí)施方案中，包含所述置換組合的醇脫氫酶對MEK比對乙醛和乙偶姻 具有增強(qiáng)的底物特異性。在另一個實(shí)施方案中，包含所述置換組合的醇脫氫酶1)對丙酮比 對MEK、乙醛和乙偶姻；和2)對MEK比對乙醛和乙偶姻；和3)對乙醛比對乙偶姻具有增強(qiáng) 的底物特異性。在一個實(shí)施方案中，包含所述置換組合的醇脫氫酶基本沒有使用乙偶姻作 為底物的能力。
[0040] 在另一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含以下置換的組合：Glyl98Asp、 Serl99Val、Pro201Glu和Tyr218Ala，并且能夠使用NADH作為輔因子。在一個實(shí)施方案中， 所述醇脫氫酶包含所有這些置換并且1)對丙酮比對MEK、乙醛和乙偶姻；和2)對MEK比對 乙醛和乙偶姻；和3)對乙偶姻比對乙醛具有增強(qiáng)的底物特異性；并且4)能夠使用NADH作 為輔因子。
[0041] 在另一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶包含以下置換的組合：Glyl98Asp、 Serl99Val、Pro201Glu和Tyr218Phe，并且能夠使用NADH作為輔因子。在一個實(shí)施方案中， 所述醇脫氫酶包含所有這些置換并且1)對丙酮比對MEK、乙醛和乙偶姻；和2)對MEK比對 乙醛和乙偶姻；和3)對乙醛比對乙偶姻具有增強(qiáng)的底物特異性；并且5)能夠使用NADH作 為輔因子。
[0042] 在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶具有SEQ ID 38中提供的序列。在一個實(shí)施方 案中，所述醇脫氫酶具有SEQ ID 42中提供的序列。在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶具有 SEQ ID 50中提供的序列。
[0043] 在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶具有SEQ ID 44中提供的序列。在一個實(shí)施方 案中，所述醇脫氫酶具有SEQ ID 46中提供的序列。在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶具有 SEQ ID 48中提供的序列。在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶具有SEQ ID 52中提供的序 列。在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶具有SEQ ID 54中提供的序列。在一個實(shí)施方案中， 所述醇脫氫酶具有SEQ ID 63中提供的序列。在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶具有SEQ ID 64中提供的序列。在一個實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶具有SEQ ID 65中提供的序列。
[0044] 在第二方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明第一方面的醇脫氫酶的核酸。
[0045] 在某些實(shí)施方案中，所述核酸具有SEQ ID 37、SEQ ID 41、SEQ ID47、SEQ ID 49、 SEQ ID 67、SEQ ID 68、SEQ ID 69或SEQ ID 70的序列。在其他實(shí)施方案中，所述核酸具 有 SEQ ID 39、SEQ ID 43、SEQ ID 45、SEQ ID 51 或 SEQ ID 53 的序列。
[0046] 在第三方面，本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明第一方面的醇脫氫酶的核酸的核酸載 體。在一個實(shí)施方案中，所述載體是表達(dá)載體。在一個實(shí)施方案中，所述編碼第一方面的醇 脫氫酶的核酸是第二方面的核酸。
[0047] 在第四方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明第二或第三方面的核酸的宿主細(xì)胞。
[0048] 在第五方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種本發(fā)明第二或第三方面的核酸的重組 微生物。
[0049] 在一個實(shí)施方案中，所述微生物能夠通過發(fā)酵產(chǎn)生一種或多種選自異丙醇、 2, 3- 丁二醇、乙醇和2- 丁醇的產(chǎn)物和任選的一種或多種其他產(chǎn)物。
[0050] 在一個實(shí)施方案中，所述微生物能夠通過發(fā)酵產(chǎn)生一種或多種選自乙偶姻、乙醒、 MEK和丙酮的產(chǎn)物和任選的一種或多種其他產(chǎn)物。
[0051] 在一個實(shí)施方案中，所述重組微生物選自包括細(xì)菌、古細(xì)菌和真菌的微生物。
[0052] 在一個實(shí)施方案中，所述重組微生物選自：梭菌屬（Clostridium)、醋酸桿 菌屬（Acetobacterium)、穆爾氏菌屬（Moorella)、丁酸桿菌屬（Butyribacterium)、 Blautia、產(chǎn)醋桿菌屬（Oxobacter)、熱厭氧桿菌屬（Thermoanaerobacter)、埃希氏菌 屬（Escherichia)、克雷伯氏菌屬（Klebsiella)、發(fā)酵單胞菌屬（Zymomonas)、朽 1檬酸 桿菌屬（Citrobacter)、腸桿菌屬（Enterobacter)、沙門氏菌屬（Salmonella)、沙雷 氏菌屬（Serratia)、乳酸桿菌屬（Lac