單細胞的多轉(zhuǎn)錄物的高通量測序的制作方法
【專利說明】單細胞的多轉(zhuǎn)錄物的高通量測序
[0001] 本申請要求2012年6月15日提交的美國臨時申請?zhí)?1/660, 370的優(yōu)先權(quán)權(quán)益， 所述案的所有內(nèi)容以引用的方式并入本文中。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 1.發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明大體上涉及分子生物學和免疫學的領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及用于高 通量分離CDNA編碼免疫細胞受體和抗體的方法。
[0005] 2.相關(guān)領(lǐng)域的描述
[0006] 存在對以高通量從單個細胞鑒別兩種或更多種轉(zhuǎn)錄物的表達的需要。具體地說， 對于許多生物技術(shù)和醫(yī)學應(yīng)用來說，以極高通量從單個細胞鑒別并且測序編碼包括適應(yīng)性 免疫受體的兩條鏈的基因?qū)σ詼蚀_測定表達于患者或?qū)嶒炇覄游镏械拿庖呤荏w的完整組 庫是重要的。由B淋巴細胞和T淋巴細胞表達的免疫受體分別由VH和VL抗體基因以及由 TCRa/β或γ/δ鏈基因編碼。人具有基于表面標志（⑶蛋白）和轉(zhuǎn)錄因子（例如Treg T淋巴細胞亞群的FoxP3)的表達被分類成不同亞群的數(shù)萬或數(shù)百萬種不同的B淋巴細胞和 T淋巴細胞。高通量DNA測序技術(shù)已用以測定相關(guān)于具體疾病狀態(tài)的淋巴細胞亞群的VH或 VL鏈的組庫，或替代地，TCRa和β的組庫，或更一般地說，以研宄適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的功能 (Wu等，2011)。免疫學研宄人員對一次高通量分析多轉(zhuǎn)錄物具有尤其大的需求。
[0007] 目前可獲得的用于免疫組庫測序的方法涉及從所關(guān)注的細胞群體，例如骨髓的 記憶B細胞或漿細胞，分離出mRNA，然后大批進行RT-PCR以合成用于高通量DNA測序的 cDNA(Reddy等，2010 ;Krause等，2011)。但是，重抗體鏈和輕抗體鏈（或a和βΤ細胞受 體）在分開的mRNA鏈上編碼并且必須分開測序。因此，這些可獲得的方法具有單獨地揭開 全部重鏈免疫組庫和輕鏈免疫組庫的可能，但還不能解決以高通量的重鏈和輕鏈配對。在 不以單細胞水平的多轉(zhuǎn)錄物分析以收集重鏈和輕鏈配對數(shù)據(jù)的情況下，包括兩條鏈的全適 應(yīng)性免疫受體不能測序或重建并且表達用于進一步研宄。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 在第一實施方案中，本發(fā)明提供一種方法，所述方法包括（a)將單細胞和mRNA捕 獲劑隔離到單獨隔室中；(b)使細胞裂解并且收集具有mRNA捕獲劑的mRNA轉(zhuǎn)錄物；（c)使 用mRNA捕獲劑從隔室分離mRNA ; (d)進行逆轉(zhuǎn)錄，然后對捕獲的mRNA進行PCR擴增；以及 (e)測序從單細胞擴增的至少兩個不同cDNA產(chǎn)物。在某些方面中，細胞可為B細胞（例如， 漿細胞或記憶B細胞）、T細胞、NKT細胞和癌細胞。
[0010] 因此，在特定實施方案中，本發(fā)明提供一種用于獲得多個成對抗原受體序列的方 法，所述方法包括：(a)用固定化寡核苷酸將單哺乳動物細胞分離于單獨隔室中用于引發(fā) 逆轉(zhuǎn)錄；(b)使細胞裂解并且允許mRNA轉(zhuǎn)錄物與固定化寡核苷酸締合；（c)進行逆轉(zhuǎn)錄，然 后進行PCR擴增以獲得對應(yīng)于單細胞的mRNA轉(zhuǎn)錄物的cDNA ; (d)測序cDNA ;以及（e)基于 測序鑒別多個單細胞的多mRNA轉(zhuǎn)錄物（例如成對抗原受體序列）。例如，在一些方面中，提 供一種用于獲得多個成對抗體VH和VL序列的方法，所述方法包括：(a)用固定化寡核苷酸 將單B細胞分離于單獨隔室中用于引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄；(b)使B細胞裂解并且允許mRNA轉(zhuǎn)錄物與 固定化寡核苷酸締合；（C)進行逆轉(zhuǎn)錄，然后進行PCR擴增以獲得對應(yīng)于單B細胞的mRNA轉(zhuǎn) 錄物的cDNA ;⑷測序cDNA ;以及（e)鑒別多個單B細胞的成對抗體VH和VL序列。在另 外方面中，提供一種用于獲得多個成對T細胞受體序列的方法，所述方法包括（a)用固定化 寡核苷酸將單T細胞分離于單獨隔室中用于引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄；(b)使T細胞裂解并且允許mRNA 轉(zhuǎn)錄物與固定化寡核苷酸締合；（c)進行逆轉(zhuǎn)錄，然后進行PCR擴增以獲得對應(yīng)于單T細胞 的mRNA轉(zhuǎn)錄物的cDNA ;⑷測序cDNA ;以及（e)基于測序鑒別多個單T細胞的成對T細胞 受體序列。
[0011] 在另外方面中，所述方法包括獲得至少10, 000個、100, 000個或1，〇〇〇, 000個單 個細胞（例如，在約100, 〇〇〇個與一千萬個或一億個之間的單個細胞）的序列。因此，在一 些方面中，所述方法包括獲得至少5, 000個、10, 000個或100, 000個個體成對抗體VH和VL 序列（例如，在約10, 〇〇〇個與100, 〇〇〇個、一百萬個或一千萬個之間的個體成對序列）。在 某一方面中，獲得如VH和VL序列的成對序列可包括通過進行重疊延伸逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈 式反應(yīng)來連接cDNA(例如，VH和VL cDNA)以連接單分子中的cDNA。在替代方面中，實施方 案的方法不包括使用重疊延伸逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(yīng)。例如，兩個（或更多個）cDNA序 列可通過測序不同分子，如通過測序不同分開的VH和VL cDNA分子獲得。
[0012] 在一個方面中，所述方法還包括使用概率分析測定天然成對轉(zhuǎn)錄物。在這個方面 中，鑒別成對轉(zhuǎn)錄物可包括比較原始測序讀長計數(shù)（read count)。例如，概率分析可包括進 行圖9的步驟。在特定方面中，方法可包括通過進行序列的概率分析鑒別成對抗體VH和VL 序列。在某些方面中，概率分析可基于⑶R-H3和/或⑶R-L3序列。在一些情況下，鑒別成 對抗體VH和VL序列可包括比較原始測序讀長計數(shù)。在另一方面中，概率分析可包括進行 圖9的步驟。
[0013] 本實施方案的某些方面涉及mRNA捕獲劑。例如，mRNA捕獲劑可為如珠粒的固體 支持物，其包括固定化寡核苷酸或如葡聚糖和瓊脂糖的聚合物網(wǎng)絡(luò)。在一個方面中，珠粒為 二氧化硅珠?；虼判灾榱！RNA捕獲劑可包括雜交mRNA的寡核苷酸。例如，寡核苷酸可包 括至少一個Poly(T)和/或?qū)λP(guān)注的轉(zhuǎn)錄物特異的引物。在某些方面中，實施方案的珠 粒小于分離的單個細胞（例如B細胞）。
[0014] 在一些方面中，實施方案的單獨隔室可為凝膠或微量滴定板中的孔。在一個方 面中，單獨隔室可具有小于5nL的體積。在一些方面中，孔可在使細胞裂解之前或在進行 RT-PCR之前用透性膜密封。在又另一方面中，單獨隔室可為乳液中的微泡。
[0015] 在另外方面中，隔離單細胞（和mRNA捕獲劑）和裂解細胞裂解（步驟（a)和（b)) 可同時進行。因此，在一些方面中，方法可包括分離單細胞和mRNA捕獲劑到乳液中并且存 在細胞裂解溶液的單獨微泡中。
[0016] 在另外方面中，實施方案的方法可包括通過進行重疊延伸逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反 應(yīng)來連接cDNA以將至少2個轉(zhuǎn)錄物連接到單DNA分子中（例如，在步驟（e)中）。在替代 方面中，步驟（e)可不包括使用重疊延伸逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(yīng)。在某些方面中，步驟 (e)可包括通過進行重組來連接cDNA。
[0017] 在又另外方面中，隔離單細胞可包括將細胞引入到包括多個微孔的裝置，以使得 大部分細胞以單細胞的形式（與mRNA捕獲劑一起，如珠粒）捕獲。在另外方面中，方法可 包括共價連接到同一珠粒的兩個或更多個轉(zhuǎn)錄物的測序。
[0018] 因此，在一些實施方案中，提供用于獲得多個成對抗體VH和VL序列的方法，其中 細胞為B細胞。在一個方面中，方法為用于獲得結(jié)合到關(guān)注抗原的抗體的成對抗體VH和VL 序列的方法。在某些方面中，珠?？删Y合到所關(guān)注抗原，并且寡核苷酸在結(jié)合到所關(guān)注抗原 的抗體的存在下僅綴合到珠粒。例如，珠?？砂灿兴P(guān)注抗原，并且mRNA捕獲劑（例如， oligo-T)可與僅在結(jié)合到抗原的抗體的存在下的珠粒締合（參見例如，圖10)。例如，mRNA 捕獲劑可與蛋白A締合或以其它方式起作用以結(jié)合到抗體（若存在）。
[0019] 實施方案的某些方面可涉及從受試者獲得樣品（例如，包括用于實施方案的方法 中的細胞的樣品）。樣品可直接取自受試者或可獲自第三方。樣品包括但不限于血清、粘膜 (例如唾液）、淋巴、尿液、糞便，和實體組織樣品。類似地，實施方案的某些方面涉及生物體 液和來自生物體液的抗體和/或核酸。例如，生物體液可為血液（例如，血清）、腦脊髓液、 滑液、產(chǎn)婦母乳、臍帶血、腹腔液、粘膜分泌物、淚液、鼻分泌物、唾液、乳汁、或泌尿生殖器分 泌物。在某些方面中，根據(jù)實施方案使用的細胞為哺乳動物細胞，如小鼠細胞、大鼠細胞或 猴子細胞。在優(yōu)選的方面中，細胞為人細胞。
[0020] 在一些方面中，實施方案中所用的細胞為B細胞，如來自所選器官如骨髓的B細 胞。例如，B細胞可為成熟B細胞，如骨髓漿細胞、脾漿細胞或淋巴結(jié)漿細胞，或外周血或淋 巴器官的細胞。在某些方面中，B細胞是基于細胞表面標志（例如，Blimp-U⑶138、CXCR4 或⑶45)的差異表達來選擇或富集。在一些情況下，獲得所選類別抗體的序列，如IgE、IgM、 IgG或IgA序列。
[0021] 在另外方面中，實施方案的方法可包括使受試者免疫（例如，在獲得細胞樣品之 前）。所述方法可還包括分離淋巴組織。淋巴組織分離可在免疫之后至少或約1、2、3、4、5、 6、6、8、9、10天或任何中間范圍。所述方法可還包括獲得淋巴組織的核酸群體，優(yōu)選地未將 B細胞從淋巴組織中分開。淋巴組織可為初級淋巴組織、次級淋巴組織或三級淋巴組織，如 骨髓、脾或淋巴結(jié)。受試者可為任何動物，如哺乳動物、魚、兩棲動物或鳥。哺乳動物可為人、 小鼠、靈長類動物、兔、羊或豬。
[0022] 為了測定核酸序列（例如，在B細胞中或在淋巴組織中），可使用本領(lǐng)域中已知 的任何核酸測序方法，其包括高通量DNA測序。高通量測序方法的非限制性實例包括合 成測