6.可溶性蛋白質(zhì)的去除及細胞器分級
[0033] 細胞裂解后，分別使用2M氯化鈉、2M氯化鉀、0. 1M碳酸鈉、4M尿素、6M鹽酸胍及 50mM碳酸氫銨緩沖溶液（ABC)清洗裂解的細胞樣品。
[0034] 7.細胞膜蛋白質(zhì)的富集
[0035] 經(jīng)清洗的細胞樣品重懸浮于50mMABC緩沖溶液中，并加入糖基肽酶于37°C孵育 12h后，利用磁力吸附取出磁性微球，將上清蛋白質(zhì)溶液凍干；
[0036] 8.細胞膜蛋白質(zhì)的酶解
[0037] 使用4%SDS (溶于50mM ABC緩沖溶液）重溶冷凍干燥的蛋白樣品 轉(zhuǎn)至離心超濾裝置的超濾管中，參照Mann，M.的FASP方法（Wisniewski，J. R. ;Zougman，A. ;Nagaraj，N. ;]\^]111，]\1他1:.]\161：]1〇(18.2009(6)，359 - 362.)完成蛋白質(zhì)樣品 的酶解過程，獲得細胞膜蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物。
[0038] 9. LTQ-〇rbitrap Velos 檢測
[0039] 酶解產(chǎn)物14000Xg轉(zhuǎn)速下離心10min，取其上清溶液，使用LTQ-〇rbitrap Velos 進行檢測。質(zhì)譜儀分析在正離子模式下進行。噴霧電壓為2. OkV，加熱毛細管溫度為200°C。 采用Xcalibur軟件記錄總離子流圖與MS譜圖；質(zhì)荷比范圍為300到1800。MS/MS譜圖采 用數(shù)據(jù)依賴模式進行采集。從一張MS全掃描中，選擇15個最強的母離子進行MS/MS的分 析。MS/MS掃描的碰撞能量為35%。
[0040] 10?數(shù)據(jù)分析
[0041] 對采集的譜圖，采用Mascot進行數(shù)據(jù)檢索，數(shù)據(jù)庫為ncbi. HUMAN. REVERSE。半胱 氨酸殘基設為固定化修飾+57. 0215Da，甲硫氨酸殘基設為可變修飾+15. 9949Da。肽段檢索 采用胰蛋白酶完全酶切，最多允許兩個漏切位點。肽段和MS/MS質(zhì)量允許偏差分別為10ppm 和0. ?a。調(diào)節(jié)Xcorr值以控制肽段鑒定的假陽性率FDR〈1%(FDR定義為采用正庫與反庫 鑒定到的肽段數(shù)量）。共鑒定到2800個蛋白group，對應10225條非冗余肽段。對鑒定到 的2800個蛋白質(zhì)，依據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot (http://www. uniprot. org)的限定進行細 胞定位，其中2500個蛋白質(zhì)（89%)的蛋白質(zhì)為細胞膜蛋白質(zhì)，此外，在鑒定到的2500個細 胞膜蛋白質(zhì)中，具有跨膜區(qū)的整合膜蛋白質(zhì)為2102個（84%)。
[0042] 鑒定結(jié)果
【主權項】
1. 一種細胞膜蛋白質(zhì)富集純化方法，其特征在于：使用功能化磁性微球捕獲作為誘餌 的細胞膜表面糖基化修飾蛋白，以富集及分析細胞膜蛋白質(zhì)，具體包括： (1) 將培養(yǎng)皿中孵育的細胞樣品消化后，向細胞樣品中加入由氧化緩沖液配制的氧化 劑溶液與細胞進行反應； (2) 氧化反應結(jié)束后，采用氧化緩沖液清洗步驟（1)中細胞樣品； (3) 向細胞樣品中加入懸浮于氧化緩沖液的帶有功能化官能團的磁性微球，室溫下震 湯 2_24h ; (4) 采用三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗步驟（3)中捕獲細胞樣品的磁性微球； (5) 將步驟（4)中捕獲細胞樣品的磁性微球重懸浮于三羥甲基氨基甲烷緩沖液，室溫下 孵育 5min-2h ; (6) 使用鹽溶液清洗步驟（5)中細胞樣品； (7) 對步驟（6)中經(jīng)清洗的細胞樣品進行裂解； (8) 使用鹽溶液清洗步驟（7)中經(jīng)裂解的細胞樣品； (9) 使用酶解或溶劑萃取的方法獲得磁性微球上富集的細胞膜蛋白質(zhì)，得所需細胞膜 蛋白樣品溶液。
2. 按照權利要求1所述細胞膜蛋白質(zhì)富集純化方法，其特征在于：步驟（1)和（2)中所 述的氧化緩沖液為醋酸鹽和氯化鹽混合緩沖液或磷酸緩沖液，醋酸鹽和氯化鹽混合緩沖液 中醋酸鹽和氯化鹽濃度分別為10_200mM，氧化緩沖液pH范圍為4-7 ; 步驟（1)中所述的氧化劑為高碘化物；氧化劑濃度為1-lOOmM;氧化反應時間為 5min_2h〇
3. 按照權利要求1所述細胞膜蛋白質(zhì)富集純化方法，其特征在于：步驟（1)中所述的細 胞樣品消化方法包括酶消化法、離子螯合法或物理法。
4. 按照權利要求1所述細胞膜蛋白質(zhì)富集純化方法，其特征在于：步驟（3)中所述的功 能化磁性微球為以四氧化三鐵/二氧化硅復合納米磁球為核，使用帶酰肼或氨基官能基團 的硅烷化試劑制備的磁性微球。
5. 按照權利要求1所述細胞膜蛋白質(zhì)富集純化方法，其特征在于：步驟（4)和（5)中所 述的三羥甲基氨基甲烷緩沖液濃度為20mM-lM ;pH為7-10。
6. 按照權利要求1所述細胞膜蛋白質(zhì)富集純化方法，其特征在于：步驟（6)和步驟（8) 中所述的鹽溶液可為濃度為〇. 1-8M的氯化鈉溶液、0. 1-8M的氯化鉀溶液、0. 1-1M的碳酸鈉 溶液、2-10M的尿素溶液、1-8M的鹽酸胍溶液或10-1000mM的碳酸氫銨溶液。
7. 按照權利要求1所述細胞膜蛋白質(zhì)富集純化方法，其特征在于：步驟（7)中所述的細 胞裂解方法包括機械裂解、化學裂解或酶裂解。
8. 按照權利要7中所述細胞裂解方法，其特征在于：若采用機械裂解或化學裂解方法 進行細胞裂解，在細胞裂解過程中需加入蛋白酶抑制劑，蛋白酶抑制劑為下列物質(zhì)中一種 或二種以上組成的混合物：AEBSF、Aprotinin、Bestatin、Sodium Pyrophosphate、E-64、 EDTA、Leupeptin、Pepstatin A、PMSF，上述物質(zhì)濃度范圍分別在 l-200mg/mL 之間。
9. 按照權利要求1所述細胞膜蛋白質(zhì)富集純化方法，其特征在于：步驟（9)中所述的磁 性微球上膜蛋白質(zhì)獲取方法如下： 若采取酶解方法，向細胞樣品中加入pH為7. 5-14的堿性緩沖溶液配制的糖基肽酶溶 液，反應6-24h使連接在磁性微球上的糖鏈斷裂以獲得磁性微球上細胞膜蛋白質(zhì)溶液；所 述的pH為7. 5-14的堿性緩沖溶液，可為碳酸氫銨緩沖鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液或三羥甲基 氨基甲烷緩沖鹽溶液； 若采取溶劑萃取的方法，向細胞樣品中加入溶有體積濃度為1%_30%的表面活性劑或 去垢劑的pH為7. 5-14的堿性緩沖溶液，超聲萃取0. 1-2h獲得磁性微球上細胞膜蛋白質(zhì)溶 液；所述的表面活性劑包括十二烷基磺酸鈉、脫氧膽酸鈉、Triton X-100、chaps、Rapigest SF或NP-40d ;去垢劑包括尿素、硫脲或鹽酸胍。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種細胞膜蛋白質(zhì)富集純化方法，該方法利用細胞膜表面整合膜蛋白質(zhì)貫穿于膜雙分子層且細胞膜表面膜蛋白質(zhì)多發(fā)生糖基化修飾的自然特征，通過功能化磁性微球捕獲作為誘餌的細胞膜表面糖基化修飾蛋白質(zhì)，實現(xiàn)細胞膜與細胞器的分離及細胞膜整合膜蛋白質(zhì)的高效富集。該方法具有細胞膜與細胞器分離效率高的優(yōu)點，可對細胞膜蛋白質(zhì)進行高效分析及表征。此外功能化磁性微球的引入，使該方法具有操作簡便，分離快速且樣品損失低的優(yōu)點。
【IPC分類】C07K1-14
【公開號】CN104628810
【申請?zhí)枴緾N201310557138
【發(fā)明人】張麗華, 方菲, 趙群, 隨志剛, 楊開廣, 張玉奎
【申請人】中國科學院大連化學物理研究所
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月8日