植物耐逆性相關(guān)蛋白VrDREB2A及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種植物耐逆性相關(guān)蛋白VrDREB2A及 其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 非生物脅迫如鹽堿、干旱、低溫、臭氧、輻射及重金屬等嚴(yán)重制約著植物的生長發(fā) 育，是農(nóng)作物產(chǎn)量與質(zhì)量的制約因素。在長期進(jìn)化過程中，植物通過細(xì)胞分子水平的耐受和 植株整體水平的協(xié)同應(yīng)答形成了一系列完善的逆境脅迫應(yīng)答機(jī)制。
[0003] DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)儆贏P2/EREBP類基因家族，能夠與抗逆基因啟動(dòng)子區(qū)域的 DRE順式作用元件結(jié)合，參與非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)植物的抗逆性。有科學(xué)家證明了擬 南芥DREB2A被脫水、高鹽脅迫誘導(dǎo)，同時(shí)DREB2A轉(zhuǎn)錄因子可激活具有DRE順式作用元件的 一系列目的基因的表達(dá)，如rd29A、corl5a、rdl7和kinl等，這些基因表達(dá)的產(chǎn)物在植物抗 逆反應(yīng)中發(fā)揮了不同的功能，此實(shí)驗(yàn)說明DREB2A蛋白直接參與植物抗逆的過程中。在提高 作物對環(huán)境脅迫的分子育種中，在將DREB2A蛋白導(dǎo)入到植物體內(nèi)可以直接提高植物的抗 逆性。
[0004] 綠豆（Vigna radiata(Linn. )Wilczek.)，屬于豆科，在中國已有兩千年的栽培歷 史。是我國重要的糧食作物。因其具有重要的營養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)用價(jià)值，現(xiàn)已作為重要的功能型 食品進(jìn)行開發(fā)。近年來，隨著種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和人們膳食結(jié)構(gòu)的改變，人們對綠豆的需求 量日益增加，種植面積卒年擴(kuò)大。研宄表明非生物脅迫嚴(yán)重影響綠豆種子萌發(fā)、幼苗生長、 產(chǎn)量等方面。鑒于此，深入研宄綠豆DREB2A參與非生物脅迫的機(jī)理，對篩選出抗旱性較強(qiáng) 的品種及抗旱育種材料的篩選具有十分重要的意義，也是解決干旱條件下綠豆生產(chǎn)的最佳 途徑之。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種植物耐逆性相關(guān)蛋白 VrDREB2A及其編碼基因與應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種植物耐逆性相關(guān)蛋白VrDREB2A，來源 于綠豆（Vigna radiata(Linn.)Wilczek.)，其氨基酸序列如SEQ ID No.l所示，或該序列經(jīng) 替換和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0007] 所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的替換和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸 殘基的替換和/或缺失和/或添加。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種與植物耐逆性相關(guān)的基因VrDREB2A，所述基因可編碼前述植 物耐逆性相關(guān)蛋白VrDREB2A。
[0009] 進(jìn)一步地，所述基因含有如SEQIDNo.2中第3-1160bp所示的核苷酸序列。
[0010] 更進(jìn)一步地，當(dāng)所述基因用于構(gòu)建重組載體、工程菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒時(shí)， 可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)在其末端構(gòu)建酶切位點(diǎn)。
[0011] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供一個(gè)5'末端的第1-6位核苷酸是 Ncol酶切位點(diǎn)，第1161-1166位核苷酸是Spel的酶切位點(diǎn)的核苷酸序列，該核苷酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。
[0012] 本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增前述基因的引物對，所述引物對的核苷酸序列分別如 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示。
[0013] 本發(fā)明還提供了含有前述基因的載體，所述載體為將前述基因插入載體 PCAMBIA1302的Ncol和Spel酶切位點(diǎn)之間得到的重組表達(dá)載體。
[0014] 本發(fā)明還提供了含有前述基因的工程菌。
[0015] 本發(fā)明還提供了前述基因在培育轉(zhuǎn)基因植物提高耐逆性中的應(yīng)用。
[0016] 進(jìn)一步地，所述應(yīng)用為利用前述重組表達(dá)載體或工程菌將所述與植物耐逆性相關(guān) 的基因VrDREB2A導(dǎo)入目的植物得到耐逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
[0017] 其中，所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性。
[0018] 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物優(yōu)選為擬南芥，如 Columbia生態(tài)型擬南芥。
[0019] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0020] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明從豆科植物綠豆中篩選到一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因 VrDREB2A，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將VrDREB2A導(dǎo)入擬南芥，經(jīng)過潮霉素初篩、分子檢測、萌發(fā)期 鹽脅迫和后期干旱脅迫等手段，篩選到抗鹽和抗干旱能力顯著提高的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。 本發(fā)明對于培育耐鹽、耐干旱的轉(zhuǎn)基因豆科作物具有重要價(jià)值。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明所述載體pCAMBIA1302-VrDREB2A構(gòu)建流程圖。
[0022] 圖2為代轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測結(jié)果；
[0023]其中：M :lkb DNA ladder，由下到上分別為 250bp，500bp，750bp，1000bp， 1500bp，2000bp ;1:陰性對照，H20 ;3;陰性對照，野生型擬南芥；3:陽性對照， 口〇八1?從1302-￥扣1?824載體；4-13和16屮〇?鑒定陽性植株 ；14、15和17屮〇?鑒定陰性植 株。
[0024] 圖3為^代轉(zhuǎn)基因擬南芥在正常生長條件下，210mM和220mM NaCl脅迫下生長7d 的萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)圖。
[0025] 圖4為1~3代轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱脅迫處理14d的存活率統(tǒng)計(jì)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0027] 以下實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0028] 以下實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0029] 以下實(shí)施例中的定量實(shí)驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0030] 中綠2號綠豆種子：由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研宄所培育（該種子向公眾免費(fèi) 贈(zèng)予）。
[0031] Columbia生態(tài)型擬南芥（哥倫比亞生態(tài)型擬南芥（Columbia stain of Arabidopsis thaliana as genetic background):購自salk公司。
[0032]農(nóng)桿菌 EHA105 記載在 Days to heading 7, a major quantitative locus determining photoperiod sensitivity and regional adaptation in rice, He Gao et al，PNAS，2014, 111 (46)，16337 - 16342中，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研宄所獲 得。
[0033] 實(shí)施例lVrDREB2A基因的克隆
[0034]1、設(shè)計(jì)特異性引物對（VrDREB2A-5' 和 VrDREB2A-3'），由 Invitrogen 公司合成。
[0035] VrDREB2A-5' ：5' -ATGGGTGCTTATGATCAAGTTTCTGTG-3' ；
[0036] VrDREB2A-3 ' ： 5 ' -TCATTCCTTGCTTGCTAGCATTTCCTTTG-3 '。
[0037] 2、提取綠豆（Vigna radiata(Linn. )Wilczek.)整株植物的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA;
[0038] 3、以步驟2的cDNA為模板，用步驟1的特異性引物對VrDREB2A-5'和VrDREB2A-3' 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0039] 4、將步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。
[0040] 測序結(jié)果為，該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因的序列為序列表中的序列2,編碼區(qū)為序列2的自 5'末端的第3-1166位核苷酸，自5'末端的第1-6位核苷酸是Ncol酶切位點(diǎn)，第1161-1166 位核苷酸是Spel的酶切位點(diǎn)。將該基因命名為VrDREB2A，該基因編碼的蛋白命名為 VrDREB2A，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列1所示，序列1由385個(gè)氨基酸殘基組 成。
[0041] 5、將上述PCR產(chǎn)物插入pMD18T_simple載體（購自TaKaRa生物工程公司），得到 載體 pMD18T-simple-VrDREB2A，測序，結(jié)果為載體 pMD18T-simple-VrDREB2A 為將序列表中 的序列2插入pMD18T-simple載體得到的載體。
[0042] 實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得和功能研宄
[0043] -、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得
[0044] 1、重組載體（pCAMBIA1302-VrDREB2A)的構(gòu)建
[0045] 構(gòu)建過程如圖1所示。
[0046] (1)用限制性內(nèi)切酶Ncol和Spel雙酶切載體pMD18T-simple-VrDREB2A，回收小 片段。
[0047] (2)用限制性內(nèi)切酶Ncol和Spel雙酶切pCAMBIA1302(購自Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture, www. cambia. org), 回收載體骨架。
[0048] (3)將步驟⑴的小片段與步驟⑵的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物，將該連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列 表中的序列2插入pCAMBIA1302的Ncol和Spel酶切位點(diǎn)之間得到的重組載體，將該質(zhì)粒 命名為pCAMBIA1302-VrDREB2A。
[0049] 2、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得 [0050] (1)農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0051] 挑取農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種于100ml YEB液體培養(yǎng)基中，220rpm、28°C振蕩培 養(yǎng)至0D6(i(i= 0. 5 ;轉(zhuǎn)入無菌離心管，5000rpm離心5min，去上清，加入10ml預(yù)冷的0. 15M的 CaCljK溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置20min ;4°C、5000rpm離心5min，去上清，加入4ml預(yù) 冷的含10%甘油（體積百分含量）和0. 15M 0&(：12的水溶液，輕輕懸浮；得到農(nóng)桿菌懸浮液 (EHA105感受態(tài)細(xì)胞），分裝于無菌eppendorf管中，每管200 y 1，于液氮中速凍lmin，凍存 于-70°C。
[0052] (2) pCAMBIA1302-VrDREB2A 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 EHA105
[0053] 取lyg上述得到的pCAMBIA1302-VrDREB2A加入200 yl EHA105感受態(tài)細(xì)胞中， 混勻，