一種雙靶點(diǎn)雙彈頭抗腫瘤融合蛋白、其編碼基因和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥用蛋白技術(shù)領(lǐng)域。具體來講，本發(fā)明涉及一種抗腫瘤融合蛋白、其編 碼基因、以該融合蛋白為活性成分的藥物以及其制藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand，腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘 導(dǎo)配體）是機(jī)體自身合成的一種細(xì)胞因子，其生理功能主要是調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)。TRAIL 主要通過細(xì)胞外凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但在后期也有線粒體通路的參與。TRAIL信號傳導(dǎo) 通路是指以TRAIL為配體，通過與死亡受體結(jié)合而啟動(dòng)凋亡信號，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究 表明，TRAIL及靶向TRAIL受體的激動(dòng)劑型抗體能夠選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而正常組 織并不敏感。
[0003] TRAIL對腫瘤細(xì)胞具有選擇性作用，目前已經(jīng)發(fā)展到II期臨床試驗(yàn)階段，并且預(yù)示 了很好的臨床應(yīng)用前景。大量研究已經(jīng)表明，TRAIL能誘導(dǎo)各種腫瘤細(xì)胞凋亡，如肺癌、乳 腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、胸腺腫瘤、白血病、多發(fā)性骨髓 瘤、黑色素瘤、骨肉瘤等。盡管早期的臨床實(shí)驗(yàn)是很令人鼓舞的，但是人重組表達(dá)的TRAIL (Human recombinant TRAIL, hrTRAIL)僅僅局限于攜帶TRAIL敏感腫瘤的患者，即使同一 組織來源的腫瘤，對TRAIL的敏感性也有差異。因此，不同腫瘤組織對TRAIL的不敏感性使 TRAIL應(yīng)用于臨床受到限制。然而，研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL與小分子藥物聯(lián)用后，不但可以克服腫 瘤對TRAIL的耐藥性，同時(shí)還可以增加療效。
[0004] 表皮生長因子受體（EGFR)異常表達(dá)是多種上皮來源的腫瘤細(xì)胞的重要特性，因此 EGFR已成為腫瘤靶向性治療的理想靶點(diǎn)。EGFR過度表達(dá)能夠拮抗死亡配體TRAIL和⑶95L 誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。如果采用針對EGFR的配體片段融合蛋白拮抗EGFR介導(dǎo)的信號通路， 那么就能增強(qiáng)TRAIL的抗腫瘤作用，并能在一定程度上克服腫瘤細(xì)胞對TRAIL的耐藥性。
[0005] 力達(dá)霉素（LDM)是由1個(gè)輔基蛋白（Lidamycin apoprotein, LDP)和1個(gè)發(fā)色團(tuán) (active enediyne chromophore,AE)組成的一種烯二炔類抗腫瘤抗生素，可以作為彈頭藥 物。其中，輔基蛋白起保護(hù)發(fā)色團(tuán)的作用，由110個(gè)氨基酸組成，分子量為10506Da，并且這 兩個(gè)部分可以拆分。研究發(fā)現(xiàn)，LDP本身在體內(nèi)具有中等程度的抗腫瘤作用，并且由于其具 有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，可以作為開發(fā)新型抗腫瘤藥物的支架載體。
[0006] 基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況，可以考慮以力達(dá)霉素輔基蛋白為支架載體，通過基因工 程的方法將TRAIL和EGFR配體寡肽與力達(dá)霉素輔基蛋白形成融合蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 基于上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種以LDP為支架具有靶向EGFR和 DR4/DR5的雙特異性融合蛋白，該融合蛋白為具有抗腫瘤作用的小分子藥用蛋白。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該融合蛋白的編碼基因。
[0009] 由于力達(dá)霉素具有可拆分和組裝的特性，本發(fā)明還提供一種與發(fā)色團(tuán)組裝的強(qiáng)化 融合蛋白。
[0010] 本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供以上述融合蛋白為活性成分的藥物以及上述融合蛋 白的制藥用途。
[0011] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：
[0012] 目前研究表明，TRAIL主要通過與靶細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活細(xì)胞凋亡路 徑而發(fā)揮其誘導(dǎo)凋亡的作用。有研究表明該機(jī)制和EGFR通路在上皮來源的細(xì)胞中相互作 用緊密。如果能夠拮抗EGFR介導(dǎo)的信號通路，那么就能增強(qiáng)TRAIL的抗腫瘤作用，并且在一 定程度上可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對TRAIL的耐藥性。本研究的目標(biāo)是構(gòu)建一種靶向EGFR和DR4/ DR5的雙特異性融合蛋白，融合蛋白含有靶向EGFR的配體寡肽，通過拮抗EGFR信號通路來 增加腫瘤細(xì)胞對TRAIL的敏感性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對TRAIL的天然耐藥性。此外，因力達(dá)霉素 具有可拆分和組裝的特性，本發(fā)明人還成功組裝了一種新的雙靶點(diǎn)強(qiáng)化融和蛋白，該雙特 異性強(qiáng)化融合蛋白由三部分組成：兩個(gè)分別靶向EGFR和DR4/DR5的寡肽配體作為導(dǎo)向分 子，力達(dá)霉素作為"彈頭"藥物，旨在利用導(dǎo)向分子的特異性將力達(dá)霉素分子帶入腫瘤細(xì)胞 中，而且由于配體的靶向性和TRAIL的選擇性作用而提高力達(dá)霉素對腫瘤細(xì)胞的選擇性， 從而降低力達(dá)霉素的副作用，同時(shí)，TRAIL具有靶向和"彈頭"的雙重作用，希望為抗腫瘤靶 向藥物的研制提供一種新的探索。
[0013] 因此，一方面，本發(fā)明提供一種抗腫瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一級氨基 酸序列結(jié)構(gòu)：
[0014] EGFR特異性把向寡肽-連接肽-力達(dá)霉素輔基蛋白-連接肽-TRAIL功能肽段；
[0015] 其中，所述EGFR特異性靶向寡肽具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，共22個(gè)氨 基酸；所述力達(dá)霉素輔基蛋白具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，共110個(gè)氨基酸；所述 TRAIL功能肽段具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列，共168個(gè)氨基酸。在本文中，將具有 上述結(jié)構(gòu)的融合蛋白命名為"Ec-LDP-TRAIL"。
[0016] 在該融合蛋白中，連接肽優(yōu)選為（GGGGS)2。選擇（GGGGS)2作為連接肽的原因在于， 一方面利于在工程菌如大腸桿菌中表達(dá)；另一方面，連接肽太短，剛性大，不利于蛋白分子 伸展，容易造成蛋白分子構(gòu)象相互遮掩，影響蛋白功能，并且力達(dá)輔基蛋白（LDP)支架分子 共110個(gè)氨基酸，具有a螺旋和0折疊，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量比較大，因此，選用（GGGGS) 2。
[0017] 所述融合蛋白具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列；或者，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
[0018] 優(yōu)選地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5所示。
[0019] SEQ ID N0:4為本發(fā)明提供的一個(gè)融合蛋白的氨基酸序列，共320個(gè)氨基酸。從 氨基端至羧基端，該融合蛋白包括：EGFR特異性靶向寡肽（Ec)，共22個(gè)氨基酸；連接肽，為 (GGGGS) 2柔性肽，共10個(gè)氨基酸；力達(dá)霉素輔基蛋白（LDP)，共110個(gè)氨基酸；連接肽，為 (GGGGS)2柔性肽，共10個(gè)氨基酸；TRAIL功能肽段，共168個(gè)氨基酸。
[0020] SEQ ID N0:5為本發(fā)明提供的一個(gè)融合蛋白的氨基酸序列，共330個(gè)氨基酸。相比 于SEQ ID N0:4,該融合蛋白在EGFR特異性靶向寡肽之前具有His和Met，在TRAIL功能肽 段的C端具有Leu和Glu以及（His) 6標(biāo)簽。
[0021] 另一方面，本發(fā)明提供上述融合蛋白的編碼基因。
[0022] 所述編碼基因具有SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；或者，所述編碼基因具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
[0023] 優(yōu)選地，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示。
[0024] 再一方面，本發(fā)明提供一種抗腫瘤強(qiáng)化融合蛋白，所述強(qiáng)化融合蛋白為本發(fā)明的 上述融合蛋白與力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)組裝而成，此強(qiáng)化融合蛋白具有TRAIL和力達(dá)霉素兩個(gè)彈 頭。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，所述強(qiáng)化融合蛋白通過包括以下步驟的方法組裝而 成：將所述的融合蛋白與力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)以1:5的摩爾比混合，于4°C下避光緩慢晃動(dòng)反應(yīng) 12~16個(gè)小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，去除多余發(fā)色團(tuán)，得到組裝成功的強(qiáng)化融合蛋白。根據(jù)本發(fā) 明的【具體實(shí)施方式】，將混合液用ro-10柱(商業(yè)化的SephadexG-25柱，Pharmacia產(chǎn)品)層 析分離，經(jīng)280nm、343nm紫外監(jiān)測后，棄去過量未反應(yīng)的AE，收集強(qiáng)化融合蛋白。
[0026] 另一方面，本發(fā)明還提供一種抗腫瘤藥物，所述藥物以本發(fā)明提供的上述融合蛋 白和/或強(qiáng)化融合蛋白為活性成分。所述抗腫瘤藥物用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的鱗狀上皮 細(xì)胞癌；優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是人。
[0027] 又一方面，本發(fā)明還提供上述融合蛋白或強(qiáng)化融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的用 途。所述抗腫瘤藥物用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的鱗狀上皮細(xì)胞癌；優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是 人。
[0028] 綜上，本發(fā)明應(yīng)用基因工程的方法提供了一種新型的具有特異性、靶向性的融合 蛋白。該融合蛋白以力達(dá)霉素輔基蛋白為支架載體，融合了 TRAIL和EGFR配體寡肽，是靶 向兩種受體（EGFR，DR4/DR5)的雙特異性融合蛋白。這種雙特異性融合蛋白的導(dǎo)向分子為 EGFR寡肽配體和DR4/DR5專一配體的可溶部分（sTRAIL)，且寡肽配體和sTRAIL位于同一 個(gè)分子上，使該融合蛋白具有較好的體內(nèi)外抗腫瘤作用。
[0029] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果在于，應(yīng)用基因工程技術(shù)制備獲得的融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL，可特異地與腫瘤細(xì)胞表面的EGFR受體和DR4/DR5結(jié)合，并能抑制腫瘤細(xì)胞 的增殖，在體內(nèi)也能明顯抑制裸鼠移植瘤的生長。此外，融合蛋白均具有較低的藥物毒性， 具有發(fā)展成腫瘤靶向性治療藥物的潛能。
[0030] 本發(fā)明所提供的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL其制備方法包括以下步驟：
[0031] 融合蛋白Ec-LDP-TRAIL重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；
[0032] 融合蛋白Ec-LDP-TRAIL在大腸埃