一類兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一類兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行性感冒病毒是一種造成人、狗、馬、豬及禽類等患流行性感冒的RNA病毒。在 分類學(xué)上，流感病毒屬于正黏液病毒科，它會(huì)造成急性上呼吸道感染，并借由空氣迅速的傳 播，在世界各地常會(huì)有周期性的大流行。2003年12月中旬，由H5N1禽流感病毒（AIV)引 起的高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza, HPAI)襲擊了亞洲，在不到2 個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，席卷了韓國(guó)、日本、中國(guó)和印度尼西亞等8個(gè)東亞和東南亞國(guó)家，導(dǎo)致死亡 或淘汰的禽只總數(shù)近1億只。在世界衛(wèi)生組織報(bào)導(dǎo)的348例確診人類感染的病例中，有216 例死亡，占60%。2010年，甲型H1N1流感病毒大流行，全球有超過18337人被該病毒奪走 生命。
[0003] 除此之外，美國(guó)⑶C的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在流感流行季節(jié)中，約50%的死亡病例死于 肺炎，其中絕大部分是肺炎鏈球菌造成的。由此可知，不僅流感病毒本身帶來嚴(yán)重危害，而 且流感病毒的感染導(dǎo)致人體的免疫力降低因而使得細(xì)菌定植的機(jī)率增加，造成細(xì)菌并發(fā)感 染，加重疾病。
[0004] 流感病毒結(jié)構(gòu)自外而內(nèi)可分為包膜、基質(zhì)蛋白以及核心三部分?；|(zhì)蛋白與病毒 最外層的包膜緊密結(jié)合起到保護(hù)病毒核心和維系病毒空間結(jié)構(gòu)的作用?；|(zhì)蛋白構(gòu)成病 毒的外殼骨架，有基質(zhì)蛋白（Ml)和膜蛋白（M2)。包膜表面具有血凝素（HA)和神經(jīng)氨酸酶 (NA)。
[0005] 甲型流感病毒命名中的H代表流感病毒的融合蛋白--血凝素（hemagglutinin， HA)，HA是流感病毒的主要抗原，共有16個(gè)亞型，可以引起宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，為逃避宿 主的免疫系統(tǒng)監(jiān)視，HA不斷突變。
[0006] 目前，治療流感病毒的藥物有兩類，作用于M2離子通道和神經(jīng)氨酸酶2個(gè)靶點(diǎn)。 (1)作用靶點(diǎn)為流感病毒表面的M2離子通道蛋白的代表藥物有金剛烷胺和金剛烷乙胺，此 類藥物在80年代獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療甲型禽流感。（2)神經(jīng)氨酸酶抑制劑不僅對(duì)甲 型流感病毒有抑制作用，還可以抗乙型禽流感病毒。此類藥物不易引起耐受性且耐受性好， 目前已上市的藥物扎那米韋（zanamivir)和奧塞米韋（oseltamivir)，對(duì)9種亞型的NA都 有抑制作用，不易引起耐藥性。
[0007] HA蛋白由HA1和HA2兩個(gè)亞基組成。在流感病毒感染宿主細(xì)胞的時(shí)候，血凝素前 體HA0水解成HA1和HA2亞基，這是是禽流感病毒具有感染性的必要步驟。其中HA1識(shí)別 并結(jié)合宿主細(xì)胞膜表面的唾液酸受體，HA2能夠協(xié)助病毒包膜與細(xì)胞膜的融合。因此任何 分子若能夠阻止HA0的水解具有抗病毒感染的活性。
[0008] 目前阻斷血凝素前體HA0水解的融合抑制劑研究成果有：一些絲氨酸蛋白酶抑制 齊II，如抗蛋白酶肽，亮肽酶素，e-aminocaproic酸，萘莫司他，肺部表面活性劑（一種具有表 面活性的脂蛋白復(fù)合物，磷脂蛋白，由小泡2型細(xì)胞產(chǎn)生），人黏液蛋白酶抑制劑都能夠在 細(xì)胞模型和動(dòng)物模型上通過抑制HAO的水解達(dá)到抗流感病毒的感染?？箟A性氨基酸蛋白酶 的擬肽抑制劑（dec-R-V-K-R-cmk)有抗H7高致病性禽流感病毒的活性，能夠抑制病毒復(fù) 制。后來研究發(fā)現(xiàn)擬肽抑制劑（dec-R-V-K-R-cmk)還可以抑制廣泛存在的2型跨膜絲氨酸 蛋白酶MPSL/TMPRSS13和其他胰島素蛋白酶如胞漿素。Kilo等人報(bào)道了 MPSL/TMPRSS13能 夠水解H5亞型和H7亞型。因此，人體中MPSL/TMPRSS13的天然抑制劑能夠作為先導(dǎo)化合 物來開發(fā)以血凝素為靶點(diǎn)的抗病毒藥物。
[0009] 目前多肽化合物抑制流感病毒有以下三個(gè)方面的研究（1)設(shè)計(jì)唾液酸類似物多 肽競(jìng)爭(zhēng)性與HA1結(jié)合Teruhiko et al等報(bào)道他們從一個(gè)隨機(jī)肽庫(kù)中篩選針對(duì)出H1和H3 病毒株的小分子多肽。篩選出來的多肽對(duì)HA有親和性。隨后他們又設(shè)置子肽庫(kù)并隨機(jī)進(jìn) 行第二和第三次篩選以找出能具有更好的與HA作用的多肽。對(duì)于最后找出來的多肽，他們 利用分子對(duì)接模擬實(shí)驗(yàn)顯示它們具有與唾液酸類似的結(jié)構(gòu)，可以競(jìng)爭(zhēng)性與HA1的受體結(jié)合 口袋結(jié)合。其中C 17H35C〇-ARLPRTMV-NH#P C 17比5(：0-41?1^1?-順2表現(xiàn)出阻止禽流感病毒H1N1 進(jìn)入宿主的高活性，其IC50分別是3. 0和1. 9 y M。
[0010] 在2006年，Jeremy C. Jones等從纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子中發(fā)現(xiàn)一個(gè)20個(gè)氨基酸 的多肽EB(NH2-RRKKAAVALLPAVLLALLAP-C00H)能特異性地與HA1結(jié)合，阻止HA與細(xì)胞表 面的受體結(jié)合，在體內(nèi)和體外都表現(xiàn)出廣譜的抗流感病毒活性。不久，一個(gè)更短的多肽 Pl(CNDFRSKTC)具有與EB同樣的抑制機(jī)制被開發(fā)出來。（2)屏蔽宿主細(xì)胞膜上的唾液酸受 體是另一種策略Teruhiko Matsubara等報(bào)道，他們從一個(gè)噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)中確定一個(gè)具 有對(duì)細(xì)胞表面唾液酸親和力的幾個(gè)多肽，并通過丙氨基酸掃描發(fā)現(xiàn)這幾個(gè)多肽中的7個(gè)氨 基酸殘基對(duì)多肽與唾液酸的識(shí)別起到關(guān)鍵性作用。這些肽與細(xì)胞表面的唾液酸結(jié)合可以 明顯抑制禽流感病毒在體內(nèi)的復(fù)制擴(kuò)散。他們通過對(duì)來自N端固醇化的兩個(gè)多肽化合物 C18-c01 (GWWYKGRARPVSAVA)和 C18-c03(RAVWRHSVATPSHSV)的多肽部分 c01 和 c03 分別進(jìn) 行烷基化，發(fā)現(xiàn)可以提高它們與唾液酸受體的結(jié)合能力，它們的IC50分別為3. 2和6. 5 y M。 (3)以HA2為靶點(diǎn)的多肽由于流感病毒與HIV病毒同屬于I類膜蛋白，有相同的進(jìn)入機(jī)制， 現(xiàn)在已經(jīng)有許多科學(xué)家正嘗試開發(fā)類似恩夫韋肽的抗禽流感病毒的多肽。但是，要復(fù)制恩 夫韋肽不是一件容易的事情。相比較HIVgp41在胞外的中性條件下介導(dǎo)的膜融合，HA介導(dǎo) 的膜融合是細(xì)胞內(nèi)的酸性條件下。因而，為了阻止融合過程，來自HA2的HR2區(qū)域的活性肽 必須事先透過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，并在酸性條件下保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。但到目前為止，僅有一組 科學(xué)家報(bào)道說來自HA2并連接膽固醇的多肽能阻止禽流感病毒和細(xì)胞膜融合和病毒感染。 他們假設(shè)由于膽固醇的作用，多肽能穿過細(xì)胞膜，在細(xì)胞胞吞的過程中進(jìn)入胞內(nèi)從而阻止 禽流感病毒和細(xì)胞的膜融合。
[0011] 此外抗流感病毒藥物研究還有：靶向血凝素的DNA疫苗、靶向血凝素的病毒載體 疫苗、靶向血凝素的類病毒粒子疫苗、靶向血凝素的重組亞單位疫苗和靶向血凝素保守序 列的疫苗。
[0012] 在抗菌方面，抗菌肽（AMPS)是宿主免疫系統(tǒng)抵抗病原微生物入侵的保守組成部 分。它們代表著一組新的抗菌藥物家族，在細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物等生物體中廣泛存在。如 今，由于細(xì)菌耐藥株的產(chǎn)生，人類迫切需要研發(fā)新的、具有更好效能的抗生素來替代老的藥 效已經(jīng)降低或者失效的抗生素。在這點(diǎn)上，因?yàn)榫哂锌焖贇⒕俾屎筒灰桩a(chǎn)生耐藥性的優(yōu) 點(diǎn)，抗菌肽被認(rèn)為是取代傳統(tǒng)抗生素的新一代候選化合物?？咕牡膩碓春軓V泛，除了天然 的防御肽，還有合理設(shè)計(jì)的合成肽。與天然的宿主防御肽相比，合成肽更易獲得、免疫原性 較低并且成本更低。
[0013] 抗菌肽的出現(xiàn)為人們尋找理想的抗菌藥物提供新的領(lǐng)域，因此抗菌肽具有巨大的 應(yīng)用潛力。自從Boman等人在1972年首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)了抗菌肽，隨后1981年Steiner 等人又從美國(guó)天蠶中成功地分離到兩種抗菌肽Cecropin-A和Cecropin-B后，截止2014 年初，已發(fā)現(xiàn)的天然AMPs超過2000條。近年來，計(jì)算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計(jì)技術(shù)的發(fā)展，極 大的促進(jìn)了抗菌肽的研究和開發(fā)，已有超過十個(gè)根據(jù)天然陽離子抗菌肽合成的類似物進(jìn) 入臨床或臨床前的試驗(yàn)階段，典型的代表是蛙皮提取的Magainins是第一種進(jìn)入藥品開 發(fā)程序的抗菌肽，美國(guó)馬蓋寧制藥公司已經(jīng)開發(fā)篩選出對(duì)細(xì)菌、病毒和腫瘤細(xì)胞均有明顯 的殺傷作用的兩種新型抗菌肽：Pexiganan(MSI-78)和MAI1278現(xiàn)已進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)， 可以預(yù)測(cè)在不久的將來抗菌肽將會(huì)成為尋找新藥的重要領(lǐng)域。TriPep公司正在研制的小 肽GPG，已經(jīng)在歐洲進(jìn)行I/II期臨床試驗(yàn)，治療兩周以上發(fā)現(xiàn)，病毒復(fù)制減慢，顯示出一 定的抗HIV應(yīng)用前景；口服抗菌肽Ambicin和Isegangn已成功地完成I期安全性評(píng)價(jià)； 加拿大MicroLogix生化技術(shù)公司的兩種抗菌肽MBI-226和MBI-594進(jìn)入II期或III期的 嚴(yán)重粉刺感染的臨床研究，其中MBI-226III期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，在誘導(dǎo)期只有極小的刺 激反應(yīng)，與陰性組對(duì)照，蓄積刺激反應(yīng)更小。最引人注目的Trimeris公司的抗HIV抗菌肽 Enfuvritide(T20)已在數(shù)年前成功上市。
[0014] 兩類治療流感病毒的藥物存在不足：其中金剛烷胺、金剛烷乙胺等藥物只能抑制 甲型禽流感，對(duì)乙型禽流感無效，用藥產(chǎn)生副作用大，而且其只作用于離子通道M2靶點(diǎn)，容 易產(chǎn)生耐藥性。同時(shí)，目前在臨床上已經(jīng)觀察到奧塞米韋的耐藥株。2009年大流行的豬流 感病毒（H1NI)就對(duì)奧塞米韋耐藥，而且這種耐藥突變獲得穩(wěn)定遺傳。扎那米韋對(duì)奧賽米韋 的耐藥株仍然有效?？茖W(xué)家在用奧塞米韋治療高致病性禽流感H5NI患者，雖然能降低患者 病毒載量，但最終不能有效降低致死率。
[0015] 一些抑制HA0水解的抗蛋白酶，氨基酸序列長(zhǎng)，成本高，機(jī)體用藥容易產(chǎn)生抗原免 疫反應(yīng)。本研究的多肽最長(zhǎng)只有22個(gè)氨基酸，相對(duì)來說，成本低，不容易產(chǎn)生免疫反應(yīng)。 [0016]目前以HA2作為靶點(diǎn)抑制流感病毒進(jìn)入宿主的研究少，僅有一組科學(xué)家報(bào)道說來 自HA2并連接膽固醇的多肽能阻止禽流感病毒和細(xì)胞膜融合和病毒感染。他們假