微流控溶液濃度發(fā)生與培養(yǎng)檢測芯片的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微流控領域，特別是涉及一種微流控溶液濃度發(fā)生與培養(yǎng)檢測芯片。
【背景技術】
[0002]在工業(yè)微生物發(fā)酵生產過程中，高效的微生物轉化是由高產菌株及最佳的培養(yǎng)條件共同決定的。傳統(tǒng)的微生物篩選主要是在搖瓶中進行的，包括微生物懸浮培養(yǎng)和培養(yǎng)液檢測兩個主要步驟。通過將每個菌株接入搖瓶中進行懸浮培養(yǎng)，繼而對搖瓶中的培養(yǎng)液進行物質檢測，從而確定菌株的性能，從中挑選出優(yōu)良的菌株。每批篩選往往需用數十上百個搖瓶進行試驗。即便如此，搖瓶篩選數量仍遠低于待篩選的菌株數量，這直接導致了篩選過程勞動強度大，篩選效率低。另外，篩選過程還會消耗大量的培養(yǎng)基及其他試劑；需要占用較大的培養(yǎng)和操作空間等等。其次，對高產菌株的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化才能最終實現高產的目的。不同微生物培養(yǎng)條件存在顯著的差異，不僅對主要碳源、氮源、磷源的種類和含量要求不同，而且對其他微量成分，如維生素等生長因子、金屬元素等也有多樣化的需求。因此，對于培養(yǎng)條件的優(yōu)化需要考察特定營養(yǎng)成分在多個濃度條件下對微生物生長發(fā)酵的影響。常規(guī)的培養(yǎng)條件優(yōu)化實驗通常在搖瓶中進行，逐個向搖瓶中加入培養(yǎng)液及特定量的營養(yǎng)成分，加入菌后再放入搖床振蕩進行培養(yǎng)。整個過程不僅需要進行大量重復性的加樣操作，而且還會用到大量搖瓶，這需要花費大量的人力，同時加樣次數越多，染菌機率較高，培養(yǎng)液的消耗量也很大，另外實驗還需要用到多個搖床，整個實驗過程效率低、成本高、時間長、需要大量的設備與空間。因此迫切需要解決培養(yǎng)條件優(yōu)化實驗中存在的這些問題。
[0003]微流控技術是上世紀九十年代在分析化學領域發(fā)展起來的，它以微管道網絡微結構特征，通過微加工技術將微管道、微泵、微閥等功能元器件像集成電路一樣，集成在芯片材料上。微流控技術具有極高的效率，由于結構微小，很容易在芯片上一次集成數十上百個微生物培養(yǎng)單元，同時可以將培養(yǎng)液同時注入多個培養(yǎng)單元，實驗效率得以提高；培養(yǎng)液及其他藥品的消耗也可大幅減少，從而降低篩選成本；微流控芯片的體積小，可以減少培養(yǎng)箱的使用量，降低微生物培養(yǎng)的所需空間和設備限制；微流控芯片可以進行批量加工生產及預處理(如清洗、滅菌等)，成為一次性試驗耗材，這樣不僅可以降低芯片的制造成本，可以減少試驗準備的工序，最終降低篩選工作的勞動強度。
[0004]目前國內外能夠進行微生物懸浮培養(yǎng)及培養(yǎng)液檢測的微流控芯片還很少，已報道的芯片還存在通量低、加工復雜、通用性不高等問題，離微生物篩選應用尚有一段距離。
[0005]Noo Li Jeon在專利W0200222264中描述了一種金字塔形能夠快速形成濃度梯度的微流控芯片，該芯片有3個溶液入口，分別注入低濃度、中濃度和高濃度溶液，經9級分支管道網絡分配混合后，混合液從9個出口流出，各出口溶液濃度形成梯度。用較少種原始濃度溶液輸入該芯片就可獲得多種濃度梯度，整個過程實現了微型化與自動化，避免了常規(guī)操作中溶液重復添加的步驟，能夠節(jié)約人力，提高操作效率。然而，該芯片設計依賴于多級分支管道網絡，隨著濃度出口數量增多，分支管道網絡級數也相應增加，這會占用較大的芯片面積，不利于后期其他芯片功能單元的集成，增加的級數也會提高注入壓力，增加了注入流速控制難度，而濃度發(fā)生受注入流速的影響很大，需要對流速進行精確控制。另外，單組金字塔形梯度發(fā)生單元產生的溶液梯度種類也比較有限，雖然可以通過多個梯度單元組合，增加數種梯度種類，但種類仍比較有限，難于滿足多樣化的濃度梯度實驗要求，且會占用較多芯片面積。
[0006]Jian Liu在專利US 2010/0104477中描述了一種基于循環(huán)混合的微流控反應陣列。該陣列包含了 400個方形閉合的液體混合單元及微閥、微泵等流體控制結構。對于每個液體混合單元可以通過控制，依次向方形單元一條邊或兩條邊的管道中注入不同液體，然后用微閥將各方形閉合單元相互隔開，啟動微泵進行單元內溶液混合。該芯片可以實現不同液體批量化的注入與混合，操作效率高，占用芯片面積小，為在芯片上實現多單元批量進樣與快速混合提供了新思路。然而，該反應陣列中各單元結構是相同的，各單元混合后產生的溶液濃度相同，無法直接用于批量化的產生多種溶液濃度，尚不能直接用于多樣化的濃度梯度實驗。
[0007]2002 年 Todd Thorsen, et al.報道了一種微流控光學比較芯片(Science 298,580 (2002) ； D01: 10.1126/science.1076996)。該芯片含有256個反應單元，每個單元包括一個容納細菌的腔室和一個容納顯色液的腔室，兩腔室間有一微閥相隔。進樣完成后，打開微閥使細菌與顯色液接觸發(fā)生反應，檢測產生的熒光信號就可以判斷細菌是否表達特定蛋白。該芯片雖然檢測通量很高，但是由于芯片中無法進行懸浮培養(yǎng)使細胞增殖，僅用于個別細菌的篩選，無法用于多樣化的微生物篩選目標，通用性不高。
[0008]2005年Nicolas Szita報道了一種多通道微流控微反應芯片(D01: 10.1039/b504243g)。該芯片集成了 4個反應腔，每個腔體中有微型攪拌槳用于實現微生物懸浮培養(yǎng)，并且安裝了兩個貼片傳感器實現對培養(yǎng)液PH和溶氧含量的檢測。該芯片雖然能夠實現微生物懸浮培養(yǎng)，并檢測培養(yǎng)液中PH和溶氧濃度，但是由于單個反應腔的體積較大，約數百微升，同時需要加工微型攪拌槳，集成貼片傳感器，制作工藝復雜，很難大幅提高芯片單元數量。
[0009]中國專利第CN201110316751.0和CN201110142095.7號分別公開了一種微流控細胞懸浮培養(yǎng)芯片，該兩件專利中提及的芯片可以實現上百通道的微生物批量平行化懸浮培養(yǎng)。然而，該芯片僅能通過細胞計數的方法確定培養(yǎng)液中的細胞數量，缺乏培養(yǎng)液檢測結構，無法對培養(yǎng)液中特定成分的濃度進行測定。
[0010]有鑒于此，有必要提供一種可以獲得特定的梯度濃度，并同時實現懸浮培養(yǎng)和分析檢測的微流控芯片。

【發(fā)明內容】

[0011]本發(fā)明的目的在于提供一種微流控溶液濃度發(fā)生與培養(yǎng)檢測芯片，可以獲得特定的梯度濃度，能夠滿足多樣的梯度濃度需求，并同時實現微生物或細胞的懸浮培養(yǎng)及培養(yǎng)液中特定成分的檢測。
[0012]為實現上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案:
一種微流控溶液濃度發(fā)生與培養(yǎng)檢測芯片，包括層疊設置的培養(yǎng)層、彈性隔膜層和驅動層，所述彈性隔膜層位于所述培養(yǎng)層和驅動層之間，所述培養(yǎng)層上分布有一個以上的培養(yǎng)檢測單元，每個培養(yǎng)檢測單元包括環(huán)形的培養(yǎng)溝道以及與所述培養(yǎng)溝道相連通的檢測溝道，所述驅動層上分布有循環(huán)驅動溝道和檢測驅動溝道，其中，所述循環(huán)驅動溝道位于所述培養(yǎng)溝道的上方且與所述培養(yǎng)溝道形成交叉，并驅動所述培養(yǎng)溝道中的培養(yǎng)液循環(huán)流動；所述檢測驅動溝道包括至少兩個驅動溝道且均位于所述檢測溝道的上方并與所述檢測溝道形成交叉，所述驅動層上還分布有第九驅動溝道，所述第九驅動溝道與所述培養(yǎng)溝道在第一位置形成交叉，該第一位置將培養(yǎng)溝道分成上培養(yǎng)單元和下培養(yǎng)單元。
[0013]優(yōu)選的，在上述的微流控溶液濃度發(fā)生與培養(yǎng)檢測芯片中，所述培養(yǎng)檢測單元還包括顯色液注入通道，該顯色液注入通道連通于所述培養(yǎng)溝道或檢測溝道，所述檢測驅動溝道位于所述循環(huán)驅動溝道和顯色液注入通道之間。
[0014]優(yōu)選的，在上述的微流控溶液濃度發(fā)生與培養(yǎng)檢測芯片中，所述顯色液注入通道呈Z形。
[0015]優(yōu)選的，在上述的微流控溶液濃度發(fā)生與培養(yǎng)檢測芯片中，所述驅動層上還分布有第三驅動溝道，該第三驅動溝道分別與所述顯色液注入通道和檢測通