一株解淀粉芽胞桿菌及其活性代謝產(chǎn)物的分離方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株解淀粉芽胞桿菌及其活性代謝產(chǎn)物的分離方法與應(yīng)用，尤其是涉及一株高效抗菌抗腫瘤野生型菌株(也CiBw1S amyloliquefacie/75BaX030)及其活性代謝產(chǎn)物的分離方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]解淀粉芽胞桿菌是一種好氧產(chǎn)芽胞的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，該菌在自然界分布廣泛，易分離培養(yǎng)，對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害，不污染環(huán)境。具有豐富的自身代謝產(chǎn)物，可以產(chǎn)生低分子量的抗生素以及抗菌蛋白質(zhì)多肽，如抗真菌蛋白(Kimet al，2004)表面活性素(Mikkolaet al, 2004; Souto et al, 2004) > 伊枯草菌素(Hiradateet al,2002; Yuet al，2002)、幾丁質(zhì)酶(Wanget al，2002)淀粉酶蛋白酶等。已有研究顯示，解淀粉芽胞桿菌對(duì)多種植物病原菌有抑制作用，Mohamed等將解淀粉芽胞桿菌與1-甲基環(huán)丙烯結(jié)合對(duì)番木瓜進(jìn)行處理后，發(fā)現(xiàn)其可以降低冷藏過(guò)程中(10°C，85%相對(duì)濕度，14天)炭疽病和擬莖點(diǎn)霉軟腐病的發(fā)病率和病情指數(shù)，并延緩果實(shí)的后熟進(jìn)程，有助于保持果實(shí)硬度和整體品質(zhì)。Alvindia等從香蕉表面分離的解淀粉芽胞桿菌DGA14對(duì)香蕉冠腐病有較強(qiáng)的抑制作用。郝建安等研究表明，解淀粉芽胞桿菌NK10.BAhjaffT菌株對(duì)茄病鐮刀菌(Fusarinmsolani)、水稻紋枯病菌、黑曲霉、黑痘病菌(ElsinoeampelinaShear)等多種真菌都有較好的抑制作用，其中對(duì)黑痘病菌的抑制效果最好，生防效果達(dá)到80.3%。郝衛(wèi)寧等研究了解淀粉芽胞桿菌對(duì)柑橘青、綠霉病的防治效果，對(duì)沙糖桔的活體接種試驗(yàn)表明，菌株HC-03的發(fā)酵液、菌懸液及發(fā)酵濾液處理柑桔綠霉病的發(fā)生率均低于20%，病斑直徑均在1mm以下。陳燕紅等從發(fā)病香蕉園香蕉根際土壤中分離獲得一株解淀粉芽胞桿菌R21g9，該菌株不僅對(duì)香蕉枯萎病菌的不同菌株具有較強(qiáng)的抑制能力，還對(duì)西瓜枯萎病病原菌(F.0xysporum f.sp.niveum)、芒果蒂腐病病原菌(Botryodiplodia theobromae Pat)和新月彎胞霉(Curvularialunata)等植物病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用。
[0003]近年來(lái)，芽胞桿菌{Bacillus、作為一類可產(chǎn)生豐富代謝產(chǎn)物的微生物類群，日益受到重視。芽胞桿菌作為益生菌廣泛應(yīng)用于害蟲防治、部分病原菌抑制和腫瘤細(xì)胞毒性三個(gè)方面，然而研究大多集中在生物防治方面，對(duì)于其抗腫瘤活性研究相關(guān)報(bào)道較少。下面重點(diǎn)介紹芽胞桿菌抗腫瘤方面的相關(guān)研究。
[0004]目前惡性腫瘤已成為威脅人類健康的頭號(hào)疾病，嚴(yán)重危害人類健康，抗腫瘤治療日益彰顯其重要性。新的治療手段及療效特異性是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。芽胞桿菌是一種昆蟲病原細(xì)菌。近年，有研究發(fā)現(xiàn)某些非殺蟲活性的芽胞桿菌能夠產(chǎn)生抗癌細(xì)胞活性的代謝物，對(duì)人類某些癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性?，F(xiàn)對(duì)這類芽胞桿菌的抗腫瘤研究進(jìn)展綜述如下。
[0005]蘇云金芽胞桿菌
日本學(xué)者M(jìn)izuki等于1999年首次發(fā)現(xiàn)了對(duì)磷翅目和雙翅目無(wú)殺蟲活性但對(duì)體外培養(yǎng)的人類白血病T細(xì)胞(M0LT-4)和人類宮頸癌傳代細(xì)胞(Hela)有殺傷力的Bt菌株。2000年，Mizuki等對(duì)分離到的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析,發(fā)現(xiàn)該類伴胞蛋白序列包含了 Bt伴胞晶體蛋白共有的5個(gè)保守區(qū)域，但與現(xiàn)有的其他Cry和Cyt蛋白同源性很低(< 25%)，只有在胰蛋白酶和蛋白酶K的作用下，降解為活性片段，此蛋白才會(huì)選擇性地毒殺M0LT-4和HeLa，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)作用，該伴胞素首次被命名為parasporin( PS)。截止目前為止，分離得到的PS蛋白主要?jiǎng)澐譃?群18類。
[0006]解淀粉芽胞桿菌
2011年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)一株對(duì)腫瘤有殺傷力的解淀粉芽胞桿菌WH1，通過(guò)對(duì)發(fā)酵上清液的分離得到脂肽類表面活性劑，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，脂肽在直接接觸腫瘤細(xì)胞的情況下，可以通過(guò)裂解細(xì)胞或者誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式抑制腫瘤細(xì)胞活性，并且當(dāng)脂肽的濃度大于50ug/mL時(shí)，脂肽類表面活性劑有明顯的體外抑制腫瘤細(xì)胞活性。研究中作者并沒(méi)有確定抗腫瘤活性物的具體分子結(jié)構(gòu)，只是推測(cè)該活性物為表面活性素(Surfactin)類脂肽，表面活性素類脂肽的分子結(jié)構(gòu)是HanYetal等在2008年確定的(該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)為一個(gè)7肽化合物和一個(gè)C14-C15的羥基脂肪酸鏈，二者通過(guò)β -羥基和羧基與肽鏈末端基團(tuán)形成內(nèi)脂環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分子量在100Da左右)，同時(shí)作者也沒(méi)有對(duì)該活性物進(jìn)行廣譜抗腫瘤活性研究，只初步探索了該活性物對(duì)小鼠S180腹水瘤一種腫瘤細(xì)胞的活性，對(duì)其他腫瘤細(xì)胞系未見研究。
[0007]枯草芽胞桿菌
2013年中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院發(fā)現(xiàn)CLPs能選擇性的作用于MCF-7細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞HELF沒(méi)有毒性，研究發(fā)現(xiàn)環(huán)脂肽對(duì)體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞的作用主要是與胞膜結(jié)合，形成離子通道，出現(xiàn)孔洞，導(dǎo)致胞內(nèi)容物外泄，細(xì)胞DNA斷裂。脂肽對(duì)細(xì)胞DNA的損傷是產(chǎn)生細(xì)胞毒作用的一個(gè)重要原因。此外，環(huán)脂肽還可以調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫機(jī)能，從體液免疫方面來(lái)抵抗癌瘤的入侵。
[0008]蠟樣芽胞桿菌
2008年中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院教育部功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)蠟樣芽胞桿菌ΖΗ-14產(chǎn)生的胞外蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞S-180的抑制率在43.6%以上。
[0009]其他
2005年廣西大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)海洋細(xì)菌Bacillus pumilus PLM4產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)人喉癌H印-2細(xì)胞活性顯著。日本金澤大學(xué)藥學(xué)院的龜田教授(1967)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)納豆芽胞桿菌對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)無(wú)害，且具有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示此抗癌活性物質(zhì)是一個(gè)含30?32個(gè)碳的直鏈飽和烴，其中活性最高、含量最大的是三i^一碳烴。納豆中還含有許多活性物質(zhì)如皂草甙、維生素B2維生素E等，每天食用可除去體內(nèi)的致癌物質(zhì)，預(yù)防癌癥的發(fā)生。雖然有關(guān)芽胞桿菌抗腫瘤的研究起始較早，但對(duì)于解淀粉芽胞桿菌抗腫瘤的研究極少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株具有廣譜抑菌與抗腫瘤活性，且抑菌與抗腫瘤活性較好的解淀粉芽胞桿菌及其活性代謝產(chǎn)物的分離方法與應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案是:
本發(fā)明之解淀粉芽胞桿菌，是解淀粉芽胞桿菌BaX030 (Bacillus 該菌種于2014年4月24日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué))保藏，菌種保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2014159。
[0012]本發(fā)明之解淀粉芽胞桿菌BaX030 (Bacillus atnyloliquefacien^>aM⑶飽分離鑒定:采用水浴加熱和稀釋平板涂布等方法，從河南花生地采集的土樣中直接分離得到一株具有解淀粉芽胞桿菌性狀的細(xì)菌，經(jīng)菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、生理生化特征、16SrRNA基因同源性分析,鑒定該菌株為BacillusMi，amyloli quefaci ens^,命名為解淀粉芽胞桿菌 BaX030 (Baci Ilus amyloli quefaci <9/?5BaX030 )。
[0013]抑菌和抗腫瘤生物活性:
將解淀粉芽胞桿菌BaX030在IL搖瓶中發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，離心，收集上清，進(jìn)行動(dòng)植物致病菌的抑菌與腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。
[0014]抗腫瘤活性物的分離純化:將解淀粉芽胞桿菌BaX030在LB培養(yǎng)基中，于30°C，160 — 170rpm/min,振蕩培養(yǎng) 48 h 后,8000 — 12000rpm/min 離心 15min ;收集發(fā)酵上清液，過(guò)0.22 μ m濾膜，得到無(wú)菌發(fā)酵上清液；在蛋白質(zhì)純化儀上進(jìn)行初步分離，收集具有生物活性的組分；利用高效液相色譜儀進(jìn)一步分離純化，得到活性代謝產(chǎn)物。
[0015]初步分離時(shí)，蛋白質(zhì)純化儀上所用凝膠柱優(yōu)選為Superdex 200葡聚糖凝膠柱。
[0016]進(jìn)一步分離純化時(shí)，所述高效液相色譜儀中所用色譜柱優(yōu)選為C18反相色譜柱。
[0017]進(jìn)一步，用高效液相色譜儀進(jìn)一步分離純化時(shí)的條件:柱子型號(hào):ZORBAX SB-C189.4X 150mm 5um,流動(dòng)相:水、甲醇,流速:4mL/min,上樣量:80 μ L,運(yùn)行方法:0_4min甲醇5%-50%、4-7min 甲醇 50%-80%、7_10min 甲醇 80%_100%、10_12min 甲醇 100%、12_13min 甲醇5% ο
[0018]目前，色譜技術(shù)已被大量應(yīng)用于細(xì)菌代謝產(chǎn)物的分離與分析，如PradipKumarSingh等利用液相色譜分離芽胞桿菌細(xì)菌素，David C等運(yùn)用色譜技術(shù)獲得蘇云金芽胞桿菌抗真菌蛋白。雖然色譜技術(shù)運(yùn)用很頻繁，但由于涉及的菌種不同和得到的活性物質(zhì)不同，分離條件也就各不相同。
[0019]利用以上分離純化方法所得解淀粉芽胞桿菌BaX030的代謝產(chǎn)物，經(jīng)LC-MS/MS抗腫瘤活性鑒定，證明:具有較好的抗腫瘤活性；具有較好的抑菌作用，抑菌譜較廣泛，對(duì)多種動(dòng)植物致病菌具有抑制作用。
[0020]解淀粉芽胞桿菌作為重要生防菌，其作用范圍涵蓋水稻紋枯病菌、香蕉枯萎病菌、西瓜枯萎病病原菌、芒果蒂腐病病原菌和新月彎胞霉等多種植物病原真菌，但對(duì)于本發(fā)明涉及到的致病菌金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、酵母菌和植物病原真菌辣椒尖胞炭疽病菌、枇杷炭疽病菌還未見報(bào)到。雖然有關(guān)芽胞桿菌抗腫瘤的研究起始較早，但對(duì)于解淀粉芽胞桿菌抗腫瘤的研究極少，目前只有華中農(nóng)業(yè)大學(xué)關(guān)于解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的表面活性素類脂肽抗腫瘤活性相關(guān)研究的報(bào)道，其表面活性素類脂肽對(duì)溫度和PH敏感，同時(shí)表面活性素類脂肽分子量在100Da左右，這與本發(fā)明中對(duì)溫度不敏感的小分子抗腫瘤活性物有本質(zhì)的區(qū)別。本發(fā)明中的抗腫瘤活性物分子量為122.14，也與表面活性素類脂肽分子量完全不同。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1是菌株amyloli quefaci ens BaX030經(jīng)分離純化后的相差顯微鏡形態(tài)特征圖；
圖2是菌株ifeci77i/5.amyloli quefaci ens BaX030經(jīng)分離純化后的掃描電鏡形態(tài)特征圖；
圖3是解淀粉芽胞桿菌BaX030菌株生長(zhǎng)曲線圖；
圖4是溫度對(duì)Bacillus amylol