一種小麥超長(zhǎng)鏈脂肪醇合成酶基因TaFAR1的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種小麥超長(zhǎng)鏈脂肪醇合成酶基因TaFARI的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 表皮蠟質(zhì)是覆蓋在植物表面最外層的保護(hù)物質(zhì)，植物葉表皮蠟質(zhì)成分復(fù)雜，通常 被認(rèn)為是一類(lèi)有機(jī)物質(zhì)的混合物，借助氣相色譜-質(zhì)譜，研究者發(fā)現(xiàn)主要的成分為長(zhǎng)鏈的 脂肪酸、醇、醒、醋和n~燒姪。植物葉表的蠟質(zhì)成分及形態(tài)在不同的種，同一種的不同生長(zhǎng) 階段，甚至同一個(gè)種的不同品種中都有變化。植物外部的非生物因素往往影響著其表皮蠟 質(zhì)的合成與分泌，蠟質(zhì)成分會(huì)因各種水、旱脅迫、臭氧、酸霧、水沖洗和污染物等的出現(xiàn)發(fā)生 變化。據(jù)研究結(jié)果表明，決定表皮水分散失程度的一個(gè)重要因素是蠟質(zhì)的化學(xué)成分，而不是 蠟層厚度。由此，作物表皮蠟質(zhì)作為一種綜合抗性指標(biāo)，在最近幾年成為國(guó)內(nèi)外的一個(gè)研究 熱點(diǎn)。目前，通過(guò)人工選育新品種來(lái)提高植物的抗旱性和果實(shí)保鮮性，既耗時(shí)又費(fèi)力，而且 效率低下；相反，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)過(guò)量表達(dá)蠟質(zhì)合成基因，可W提高植物表皮蠟質(zhì)含量，提 高植物的抗旱性和果實(shí)的保鮮，既方便又快捷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種小麥超長(zhǎng)鏈脂肪醇合成酶基因TaFARI 的應(yīng)用，該小麥超長(zhǎng)鏈脂肪醇合成酶基因TaFARI可調(diào)控超長(zhǎng)鏈脂肪醇合成，從而可提高植 物表皮蠟質(zhì)成分。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案是，
[0005] 本發(fā)明之SEQ ID NO ;1所示的小麥超長(zhǎng)鏈脂肪醇合成酶基因TaFARI在植物育種 中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢獲得FAR基因的序列信息，W小麥品種明988苗期葉 片的cDNA為模板，W序列如SEQ ID No ;2和SEQ ID No ;3所示的上下游引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，獲得TaFARI基因的全長(zhǎng)序列如SEQ ID No ;1所示；經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將得到的TaFARI 基因的1578bp編碼區(qū)連接到35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)雙元載體pCXSN，獲得融合表達(dá)載 體TaFARl-pCXSN ;轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，并將測(cè)序確認(rèn)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，通過(guò)農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化植物品種，獲得過(guò)量表達(dá)TaFARI的轉(zhuǎn)基因植株。
[0007] 本發(fā)明之SEQ ID NO ;1所示的小麥超長(zhǎng)鏈脂肪醇合成酶基因TaFARI在提高植物 抗旱能力中的應(yīng)用。
[000引本發(fā)明之SEQ ID NO ;1所示的小麥超長(zhǎng)鏈脂肪醇合成酶基因TaFARI在提高果實(shí) 保鮮中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明之SEQ ID NO ;1所示的小麥超長(zhǎng)鏈脂肪醇合成酶基因TaFARI在培育產(chǎn)超 長(zhǎng)鏈脂肪醇的酵母菌株中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明將帶有化nd III和EcoR I酶切位點(diǎn)的TaFARI編碼區(qū)連接到經(jīng)過(guò)化nd III 和EcoR I雙酶切的酵母表達(dá)載體PYES2,獲得融合表達(dá)載體TaFARl-pYES2,轉(zhuǎn)化大腸桿菌 D冊(cè)a，挑選陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后，提取質(zhì)粒DM,通過(guò)陽(yáng)G法轉(zhuǎn)入釀酒酵母菌株。
[0011] 本發(fā)明之小麥超長(zhǎng)鏈脂肪醇合成酶基因TaFARl的應(yīng)用，與現(xiàn)有技術(shù)相比，可使獲 得表達(dá)TaFARl基因的酵母發(fā)酵生產(chǎn)超長(zhǎng)鏈脂肪醇，也可使過(guò)量表達(dá)TaFARl基因的植物抗 旱性顯著增強(qiáng)，生產(chǎn)的果實(shí)保鮮時(shí)間延長(zhǎng)。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步加W說(shuō)明。
[0013] 實(shí)施例1 ;培育產(chǎn)超長(zhǎng)鏈脂肪醇的釀酒酵母菌株的實(shí)驗(yàn) UTaFARl基因的克??；從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢獲得FAR基因的序列信息，W小麥品種明 988苗期葉片的cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物為； TaFARl(F) ;5' ATGGTGGGCACGCTGGATGAGG 3'，如 SEQ ID No ;2 所示； TaFARl(R) ;5, TCACTTGAGGACGTACTTCATG 3，，如沈Q ID No ;3 所示； PCR反應(yīng)體系為；在50yl反應(yīng)體系，內(nèi)含DNA模板5yl，上下游引物各2. 5yl，dNTP 10 y 1，Buffer 25 y 1，KOD 聚合酶 1 y 1，d地204 y 1 ;PCR 反應(yīng)程序；94°C預(yù)變性 2min ;98°C 變性10s、60°C退火30s、68°C延伸2min，共進(jìn)行35次循環(huán)；68°C延伸10min，10°C保存；進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收純化后，連接到克隆載體pM護(hù)M 18-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)a，挑選 陽(yáng)性克隆測(cè)序，獲得TaFARl基因的全長(zhǎng)序列，如SEQ ID No ;1所示。 2、 構(gòu)建TaFARl基因表達(dá)載體：將帶有化nd III和EcoR I酶切位點(diǎn)的TaFARl編 碼區(qū)連接到經(jīng)過(guò)化nd III和EcoR I雙酶切的酵母表達(dá)載體PYES2,獲得融合表達(dá)載體 TaFARl-pYES2,轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)a，挑選陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序確認(rèn)。 3、 獲得表達(dá)TaFARl基因的酵母；提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)PEG法轉(zhuǎn)入釀酒酵母菌株INVScl， 挑選酵母菌落的單克隆，提取酵母DNA，通過(guò)TaFARl基因的擴(kuò)增和測(cè)序，篩選獲得轉(zhuǎn)TaFARl 基因的酵母的陽(yáng)性克隆。 4、 轉(zhuǎn)基因酵母發(fā)酵生產(chǎn)超長(zhǎng)鏈脂肪醇：挑選3~5個(gè)單克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng) 后，收集菌體、裂解，用己燒抽提，通過(guò)氣相色譜（GC-M巧檢測(cè)菌體脂質(zhì)抽提物，能夠檢測(cè)到 Cw醇，表明TaFARl基因在轉(zhuǎn)基因酵母中可W催化產(chǎn)生C 2。醇。
[0014] 實(shí)施例2 ;轉(zhuǎn)TaFARl基因的植物抗旱性實(shí)驗(yàn) 1、 TaFARl基因的克?。慌c實(shí)施例1相同。 2、 構(gòu)建TaFARl基因表達(dá)載體：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，連接到35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 植物表達(dá)雙元載體pCXSN，獲得融合表達(dá)載體TaFARl-pCXSN，轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)a，挑選陽(yáng) 性克隆測(cè)序確認(rèn)。 3、 獲得表達(dá)TaFARl基因的植物；提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn) 化小麥品種西農(nóng)979,獲得轉(zhuǎn)TaFARl基因的轉(zhuǎn)基因植株。利用SDS法提取轉(zhuǎn)基因植株的 DM，具體步驟如下；（1)取半張至一張葉片（-80°C保存的葉片），在-20°C預(yù)冷的研鉢中用 液氮研取液氮粉末1/3~1/2管；（2)加入600 y 1 SDS提取液搖勻，65°C溫浴30min，間或 振蕩3~4次，溫浴至樣液變墨綠色；（3)加入100 y 15M KAC(l/4體積）、搖勻后置冰上 約半小時(shí)；(4)加入300~400 y 1 (等體積）氯仿-異戊醇（24 : 1)，在振蕩器上充分搖 勻（120;rpm、30min) ;(5)離屯、化000~8000;rpm、15min)，要注意配平；（6)轉(zhuǎn)移上清液至另 一巧pendo計(jì)管中，400 y 1左右；（7)加入等體積（400 y 1左右）氯仿-異戊醇（24 : 1)， 振蕩器上搖勻巧0~90巧m、30min)(液面分S層，下層顏色較深，上層微帶黃綠色）；（8) 離屯、（6000 ~8000;rpm、15min) ; (9)轉(zhuǎn)移上清液至一新的 eppendo;rf 管中（300 ~400ul 左右）；（1〇)加入-2〇°c預(yù)冷的無(wú)水己醇（2倍體積）至一定刻度，稍微晃動(dòng)；（ii)-2(rc 冰箱保存20min后離屯、（12000巧111、61