用本領域技術人員熟知的DNA重 組、PCR等各種技術來獲得，但不局限于本發(fā)明較佳實施方案中采用的兩輪重疊延伸延伸 PCR 法。
[0018] 編碼本發(fā)明嵌合蛋白的多核巧酸可包括W下；僅該嵌合蛋白的編碼序列、嵌合蛋 白編碼序列及額外的編碼序列（如前導或分泌序列或前蛋白質序列）；嵌合蛋白的編碼序 列及非編碼序列（如內含子）。因此，術語"編碼嵌合蛋白的多核巧酸"所指的多核巧酸可能 不僅含有嵌合蛋白的編碼序列，還含有包括額外編碼序列和/或非編碼序列的多核巧酸。
[0019] 將本發(fā)明的多核巧酸與相應表達載體進行有效連接后，轉化或轉導入宿主細胞中 表達。上述載體可附加體或整合到宿主染色體的形式在宿主生物中進行復制。在適當 的啟動子控制下，尿酸酶嵌合蛋白可W在哺乳動物細胞、昆蟲、酵母、細菌或其它細胞中表 達。優(yōu)選的，選擇大腸桿菌克隆本發(fā)明的多核巧酸。其他適用的微生物宿主包括枯草芽抱 桿菌炬acillus subtilus)、沙雷氏菌屬（Serratia)、假單胞菌屬（Pseudomonas)和葡萄球 菌屬（Staphylococcus)等。也可W在該些原核宿主中制備表達載體，還可能具有眾多公知 啟動子中的任一種，如乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸啟動子系統(tǒng)、0內酷胺酶啟動子系統(tǒng)或瞻菌 體A或T7來源的啟動子系統(tǒng)。通常該些啟動子會控制表達，且具有核糖體結合位點序列 等，W便起始和完成轉錄及翻譯。
[0020] 酵母或真菌等的其他微生物也可用于表達。優(yōu)選的酵母宿主為畢赤酵 母（Pichiapastoris)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe) W 及嗜甲醇畢赤酵母（Pichia angusta)。真菌宿 主包括黑曲霉（Aspergillus niger)、里氏木霉（Trichoderma reesei)及裂權菌 (Schizophyllumcommune)，但也可選擇使用其他真菌。
[0021] 哺乳動物細胞培養(yǎng)也可用于表達生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白。優(yōu)選的細胞包括；CH0細胞 系、多種COS細胞系、NS0細胞、敘利亞地鼠（Syrian Hamster)卵巢細胞系、化la細胞或人 胎腎細胞系（即肥K293、肥K293邸NA)。
[0022] 可W通過公知的方法將含有目的多核巧酸序列（如尿酸酶嵌合蛋白及表達控制 序列）的載體轉移到宿主細胞內，所采用的方法取決于細胞宿主的類型。例如，對原核細胞 通常采用氯化巧轉染法，而對于其他細胞宿主可W使用磯酸巧處理或電穿孔法。
[0023] 如前獲得的本發(fā)明重組尿酸酶嵌合蛋白可W從宿主細胞內部或外部（如培養(yǎng)基） 分離得到，且純化為高純度的均一蛋白。此種蛋白分離純化的方法不限于任何特定方法。 事實上，可用任何本領域已公知的方法，例如柱層析法、過濾法、超濾法、鹽析法、等電點沉 淀法、透析法等。對于層析，例如親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析、反相層 析、吸附層析等都可W應用。該些層析可用液相層析如HPLC和FPLC來操作?？捎猛ㄓ玫?蛋白檢測方法檢測蛋白濃度和純度，例如HPLC法、SDS-聚丙締酷胺電泳法、等電點電泳法、 BCA法、Lowir法、Western Blot法等。因此，本發(fā)明可提供高純度重組的尿酸酶嵌合蛋白。
[0024] 至此已對本發(fā)明進行了詳細描述，參照W下實例能夠對之有更清楚的理解，所述 實例僅為說明目的而并不旨在對本發(fā)明進行限制。
【附圖說明】
[0025] 圖1 ;人、豬尿酸氧化酶基因瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中M為DNA分子質量標準 Marker II;泳道1為豬尿酸酶全長基因巧36bp);泳道2為人尿酸酶全長基因巧36bp)
[0026] 圖2 ;人豬嵌合尿酸酶蛋白H1P2-6H7-8外顯子片段與全長的瓊脂糖凝膠電泳圖。 圖中1，泳道1為化P2-6外顯子片段（780bp)，泳道2為H7-8外顯子片段（193bp);圖中2 為人豬嵌合尿酸酶蛋白H1P2-6H7-8全長基因片段巧36bp)
【具體實施方式】
[0027] 實例1重組人豬嵌合尿酸酶蛋白化P2-6H7-8的構建
[002引獲得質粒模板：接種分別含有人尿酸氧化酶基因和豬尿酸氧化酶基因大腸桿菌工 程菌甘油管，接種量為1%，過夜培養(yǎng)，提取質粒。
[0029] 獲得H1P2-細7-8DNA ;第一階段PCR;模板序列為祀T-22b(+)-PU，引物為引物 1(與人的1號外顯子氨基酸序列一致）和引物3，PCR條件為；95°C30s，55°C30s，72°C Imin 30s，共30個循環(huán)，第一個循環(huán)95°C變性5min，最后一個循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn) 物H1P2-6片段；第二階段PCR ;模板序列為祀T-22b (+)-皿，引物為引物4和引物2, PCR條 件為；95°C 30s，55°C 30s，72°C 30s，共30個循環(huán)，第一個循環(huán)95°C變性5min，最后一個循環(huán) 72°C延伸lOmin，最終獲得H7-8片段；第S階段PCR ;模板為P1-6片段、H7-8片段1 : 1的 混合液，引物為引物1和引物4, PCR條件為；95°C 30s，55°C 30s，72°C 2min，共30個循環(huán)， 第一個循環(huán)95°C變性5min，最后一個循環(huán)72°C延伸lOmin，最終獲得產(chǎn)物H1P2-細7-8DNA 片段。各引物序列如下。
[0030] 各實施例所用引物序列
【主權項】
1. 一種重組人豬嵌合尿酸酶蛋白，其特征在于哺乳動物豬來源的尿酸酶中含有部分人 來源的尿酸酶氨基酸序列。
2. 如權利要求1所述的重組人豬嵌合尿酸酶蛋白，其特征在于：豬尿酸酶蛋白基因的1 號外顯子被人尿酸酶蛋白基因的1號外顯子替換。
3. 如權利要求2所述的重組人豬嵌合尿酸酶蛋白，其特征在于：豬尿酸酶蛋白基因的7 號外顯子被人尿酸酶蛋白基因的7號外顯子替換。
4. 如權利要求3所述的重組人豬嵌合尿酸酶蛋白，其特征在于：豬尿酸酶蛋白基因的8 號外顯子被人尿酸酶蛋白基因的8號外顯子替換。 5. DNA分子，其特征在于：它編碼權利要求4中的重組人豬嵌合尿酸酶蛋白。
6. 表達載體，其特征在于：它含有權利要求5中所述的DNA分子。
7. 宿主細胞，其特征在于：它含有權利要求6中所述的表達載體，其中所述宿主細胞包 括大腸桿菌細胞、酵母細胞、CHO細胞。
8. 如權利要求1中所述的重組人豬嵌合尿酸酶蛋白，其特征在于：它具有高的尿酸酶 活性。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種有酶活的人豬嵌合尿酸酶蛋白，以及編碼該嵌合蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細胞，用基因工程制備該嵌合蛋白的方法。本發(fā)明的嵌合蛋白既保留了哺乳動物來源尿酸酶活性，又增加了與人體尿酸酶的同源性，從而降低了人體適用的免疫原性。同時增強或改善了哺乳動物來源尿酸酶蛋白的理化性質，更適用于高尿酸血癥及其引起的痛風的治療。
【IPC分類】C12N15-70, C12N15-85, C12N15-81, C12N15-53, C12N9-06
【公開號】CN104630168
【申請?zhí)枴緾N201510066745
【發(fā)明人】陳建華, 李苗苗, 蔣楠
【申請人】中國藥科大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月4日