一種混合蛋白酶體系、包含該混合蛋白酶體系的試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種混合蛋白酶體系、包含該蛋白酶 體系的試劑盒及其使用方法，尤其設(shè)及一種用于基因克隆與組裝的混合蛋白酶體系、包含 該混合蛋白酶體系的試劑盒及其用于基因克隆與組裝的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 重組DNA化ecombinant DNA)技術(shù)是指在生物體外，按照人們的需要將不同來源 的DNA分子進行人工改造和重新組合，形成嵌合DNA分子間limeric DNA Molecules)，然 后將之導(dǎo)入受體細胞使重組基因在受體細胞內(nèi)擴增表達，從而使受體細胞獲得新的遺傳特 性，產(chǎn)生出人類所需要的新的基因產(chǎn)物。例如，在合成生物學(xué)領(lǐng)域利用組合型啟動子的方 法，通過構(gòu)建人工組合型啟動子文庫替代染色體上自身啟動子來調(diào)節(jié)并優(yōu)化相關(guān)代謝通路 中多個基因的表達，調(diào)節(jié)染色體基因組功能，最終定向選擇出所需性質(zhì)的產(chǎn)物。但在重建基 因組過程中，仍面臨很多瓶頸。首先，化學(xué)合成的寡核巧酸片段長度有限，化學(xué)合成寡聚核 巧酸片段的能力一般局限于150~2(K)bp。其次，目前直接通過PCR擴增10化W上的大片 段基因組DNA仍然是一個很大挑戰(zhàn)。因此為獲取DNA大片段，必須將多個不同小片段加W 組裝，該就設(shè)及到DNA多片段的組裝。比較常見的DNA組裝方法有連接酶拼接法（Ligase 化ain Reaction, LCR)，該法是經(jīng)過熱循環(huán)反應(yīng)，用耐熱性DNA連接酶將首尾相連、重疊雜 交的寡核巧酸片斷連接起來的反應(yīng)；另一種方法是聚合酶拼接法（Polymerase切cling Assembly, PCA)，即直接利用耐熱性DM聚合酶，經(jīng)過熱循環(huán)反應(yīng)將兩頭重疊雜交的寡核巧 酸片斷步步延伸，最后合成全長基因，上述方法優(yōu)點是操作簡便，但當需要多輪的克隆操作 時，非常耗時、設(shè)計困難，隨著實驗次數(shù)的增加可能引入無謂的突變（如紫外線照射，酶的 非特異性切割所致）。近幾年，一類基于同源重組的DNA體外組裝新方法相繼產(chǎn)生。同源重 組是通過同源區(qū)發(fā)生的，同源區(qū)指的是發(fā)生重組的兩個分子共享的一段DNA。該類方法是利 用DNA外切酶將末端有較長同源序列的雙鏈片斷的5' -或3'端修短，DNA片段之間依靠同 源序列退火，使突出的3' -或5'端相互雜交，然后用DNA聚合酶和連接酶將缺口補齊和連 接，最終將可實現(xiàn)兩個或多個DNA片段組裝成全長。目前已有多個商業(yè)化的重組反應(yīng)試劑 盒都是基于此技術(shù)的原理開發(fā)的，如
[000引1)基于T4 DNA聚合酶克隆試劑盒，是依賴于T4在無dNTPs的情況下發(fā)揮其外切 酶活性，在常溫（如25°C，30分鐘）能將DNA雙鏈片斷的5' -端修短，使3' -端產(chǎn)生15-20 堿基突出的同源序列，然后相互雜交，用T4聚合酶本身和連接酶將缺口補齊和連接。
[0004] 。利用ExoIII的克隆試劑盒則利用ExoIII 3' 一 5'核酸外切酶活性，在低溫（如 4°C )狀態(tài)下經(jīng)30分鐘的解育處理，DNA片段5'-端產(chǎn)生約15-30堿基的序列懸掛區(qū)；相鄰 片段的懸掛區(qū)是互補序列，經(jīng)過退火處理而組裝在一起。
[0005] 3)依靠T7或T5外切酶的克隆試劑盒是利用核酸外切酶能從5' -或3'端降解核 巧酸，雙鏈DNA被消化產(chǎn)生突出的單鏈DNA，重疊序列特異性退火。通常它需要在37°C溫度 下反應(yīng)15-30分鐘。
[0006] 同源重組的作用機理不受酶切位點限制，只要供體和受體DM分子間具有一段相 同的堿基序列（即所謂的同源臂）兩者就能發(fā)生重組或替換，而且由于同源臂可W人為選 擇，因此同源重組方法特別適用于多個DNA片段的平行組裝，已廣泛應(yīng)用于基因克隆、定點 突變、基因剪接等研究中。然而，現(xiàn)有的基于同源重組的基因克隆和組裝方法還存在一些弊 病；如上述的同源重組方法都要求在較低溫度（如4°C -37°C )條件下完成重組反應(yīng)，但在 低溫甚至常溫條件下同源臂之間容易發(fā)生非特異性退火，尤其當組裝片段較多、序列高度 重復(fù)或GC含量高時，由于重組反應(yīng)溫度過低而導(dǎo)致非特異性退火現(xiàn)象更加嚴重，容易造成 錯誤的組裝而產(chǎn)生DNA片段變異，尤其在進行SNP研究時，很難區(qū)分所檢測出的單個核巧酸 突變是基因組中本身存在的還是因克隆和組裝過程中人為引入的，因此現(xiàn)有的同源重組方 法都不能確?；蚩寺『徒M裝的精確性。
[0007] 增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)是分子量為 36kDa的酸性核蛋白。最初是在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中首次發(fā)現(xiàn)并命名，后來經(jīng)研究發(fā) 現(xiàn)PCNA廣泛存在于各類組織的增殖細胞中。PCNA是生物復(fù)制復(fù)合體的核屯、成分，具有特殊 的環(huán)狀S級結(jié)構(gòu)，作為DNA聚合酶5的推動因子，PCNA可與許多與DNA復(fù)制相關(guān)的蛋白結(jié) 合，協(xié)調(diào)DNA復(fù)制過程；同時PCNA還作為功能轉(zhuǎn)換因子，通過不同調(diào)控方式與多種細胞因子 作用，參與了 DNA損傷修復(fù)、細胞周期調(diào)控及調(diào)亡等許多重要的細胞事件。但細胞外PCNA 在DNA同源重組反應(yīng)中的作用尚有待發(fā)現(xiàn)。
[000引鑒于目前的研究，如何構(gòu)建一種用于高保真基因克隆與組裝的酶體系及包含該酶 體系的試劑盒是目前亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目標在于提供一種混合蛋白酶體系、包含該混合蛋白酶體系的試劑盒及 其使用方法，特別是一種用于高保真基因克隆與組裝的混合蛋白酶體系、包含該混合蛋白 酶體系的試劑盒及其用于基因克隆與組裝的方法。
[0010] 為達到此發(fā)明目標，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0011] 第一方面，本發(fā)明提供了一種用于基因克隆與組裝的混合蛋白酶體系，該混合蛋 白酶體系在40-70°C下仍然保持活性。
[0012] 本發(fā)明中的混合蛋白酶體系可W在40 °C、42 °C、45 °C、48 °C、50 °C、52 °C、55 °C、 58°C、60°C、62°C、65°C、68°C、70°C下仍可保持活性，優(yōu)選為42-60°C下仍可保持活性。
[0013] 本發(fā)明通過采用上述高溫下仍可保持活性的蛋白酶構(gòu)成所述混合體系，有效避免 了由于低溫甚至常溫條件下同源臂之間容易發(fā)生的非特異性退火現(xiàn)象，提高了重組反應(yīng)的 精確性，保證了基因克隆與組裝的保真性，降低了突變幾率。
[0014] 本發(fā)明中，所述混合蛋白酶體系包含嗜熱性增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)。本發(fā)明利用嗜熱性增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)具有將單鏈DNA結(jié)合蛋白及DNA聚合酶募集到DNA修補位點的功 能，不僅可W有效啟動同源重組機制，而且保證了同源重組過程中DNA的延伸修補更加有 效，確保了基因克隆和組裝的精確性。
[0015] 優(yōu)選地，所述嗜熱性增殖細胞核抗原為來源于激烈熱球菌的增殖細胞核抗原 (P化-PCNA)或超嗜熱菌的增殖細胞核抗原化OD-PCNA)中的任意一種或兩種的混合物。
[0016] 本發(fā)明中，所述混合蛋白酶體系還包含核酸外切酶、嗜熱性單鏈DNA結(jié)合蛋白或 嗜熱性DNA聚合酶中的任意一種或至少兩種的混合物。
[0017] 本發(fā)明優(yōu)選采用核酸外切酶、嗜熱性單鏈DNA結(jié)合蛋白、嗜熱性DNA聚合酶和嗜熱 性增殖細胞核抗原共同構(gòu)成所述的混合蛋白酶體系。
[0018] 本發(fā)明采用上述4種酶組成的混合蛋白酶體系時，4種酶之間發(fā)揮協(xié)同作用。本發(fā) 明利用核酸外切酶活性、W及PCNA將單鏈DNA結(jié)合蛋白及DNA聚合酶募集到修補位點的協(xié) 調(diào)作用，實現(xiàn)在細胞體外將多個帶有重疊區(qū)的DNA片段組裝起來，最后，利用感應(yīng)態(tài)細胞在 體內(nèi)自動完成修復(fù)過程，其具體作用機理如下：
[0019] 本發(fā)明進行DNA無縫克隆大致需要W下四個步驟來完成；（1)兩個或者多個雙鏈 DNA片段經(jīng)核酸外切酶酶切后，DNA雙鏈中的一條鏈末端的部分堿基被切去片段，產(chǎn)生約 15-30bp的序列懸掛區(qū)；（2)由于相鄰片段的懸掛區(qū)是互補序列，在較高的溫度下，可W特 異性地使相鄰DNA片段在單鏈重疊處之間結(jié)合在一起，形成具有缺口的長DNA片段，而嗜熱 性單鏈DNA結(jié)合蛋白能夠使該種結(jié)合更加穩(wěn)固；（3)嗜熱性DNA聚合酶在嗜熱性增殖細