制備與篩選改變特異性蛋白酶的方法
【專利說明】制備與篩選改變特異性蛋白酶的方法
[0001] 本申請是2003年10月2日提交的題為"制備與篩選改變特異性蛋白酶的方法"的 中國專利申請200380102653. 0的分案申請。
[000引發(fā)明背景
[0003] 酶可W應用于廣泛的領域。一組重要的酶族是斷裂蛋白的蛋白酶。許多蛋白酶在 特定的底物序列上特異性地斷裂祀蛋白。由蛋白酶特異性斷裂的趨勢被稱為底物特異性， 或者底物序列特異性。與多族溶解蛋白酶不同成員有關的底物特異性部分歸因于結合區(qū)域 內不同組的氨基酸，每個酶族都利用該種結合區(qū)域內的氨基酸識別底物，并起到催化作用。 針對一些蛋白酶，已經(jīng)成功地研究出設計變異酶的合理方案。從結合裂隙保留的結晶數(shù)據(jù) 獲知，枯草桿菌蛋白酶的保守氨基酸殘基（甘氨酸166)可W改變成多種不同氨基酸殘基 中的一種氨基酸殘基。所得的酶衍生物表現(xiàn)出底物特異性的明顯變化，并伴隨著疏水性與 氨基酸大小的增長（Wells等人，Cold Spring Harb，《癥狀定量生物學》第1987年第52期 第647-652頁）。人們還合理地改變了另一種細菌編碼的絲氨酸內膚酶（endop巧tidase)、 a -溶解蛋白酶，將其192甲硫氨酸改變?yōu)楸彼?。在其活性位點內獲得的變異表現(xiàn)出增加 了酶活性位點的結構柔性。對于更大型、疏水性更強的祀，所得的a-溶解蛋白酶衍生物具 有了更廣泛的底物特異性炬one等人，《生物化學》1991年第43期第10388-10398頁）。
[0004] 絲氨酸蛋白酶是廣泛研究的與W其所謂催化S合體；天冬氨酸一組氨酸一絲氨酸 為特征的內膚酶相關的族。在相似蛋白的族中，保留第一、第二和第=結構的區(qū)域趨向于含 有設及活性位點的殘基，W及對活性很重要的其它殘基。例如，盡管催化=合體的成員遠離 絲氨酸蛋白酶的第一結構（氨基酸結構），但是，該些殘基對準了該些蛋白第=結構（或者 折疊）形成的結合區(qū)域。
[0005] 絲氨酸蛋白酶在底物序列識別特性方面差別很大：一些絲氨酸蛋白酶具有強特異 性（即，設及血液凝固和免疫補體系統(tǒng)的蛋白酶）；一些絲氨酸蛋白酶只具有部分的特異性 (即，哺乳動物消化蛋白酶，膜蛋白酶和膜凝乳蛋白酶）；并且其它類型的絲氨酸蛋白酶，象 枯草桿菌蛋白酶，一種細菌蛋白酶，完全不具備特異性。盡管存在特異性差異，絲氨酸蛋白 酶的催化機理還是非常保守的，由底物序列結合位點構成，此結合位點準確定位于活性位 點中帶有五個氨鍵的易切斷膚。一旦與該種易切斷膚結合，催化=合體的=個恒定殘基之 間的氨鍵網(wǎng)絡就催化產生了此膚鍵的水解。盡管催化機理高度保守，但是該種大族蛋白酶 在序列特異性方面可W具有廣泛的差異。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明設及制備并篩選斷裂公知設及疾病蛋白的蛋白酶。所得的蛋白可W作為生 命體內的治療劑。
[000引本發(fā)明廣泛設及改變底物序列特異性的蛋白酶修飾，W致修飾蛋白酶斷裂了設及 或者造成病癥的祀蛋白。在本發(fā)明一【具體實施方式】中，修飾的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。在 本發(fā)明另一【具體實施方式】中，修飾的蛋白酶是半脫氨酸蛋白酶。
[0009] 本發(fā)明一具體實施設及制備蛋白酶序列庫，用于篩選在所需底物序列處斷裂所需 祀蛋白的蛋白酶。在此【具體實施方式】的一個方面，序列庫的每個成員是帶有針對其自身產 生多種變異的蛋白酶支架。蛋白酶支架具有與公知蛋白酶相同或者相似的序列。在一具體 實施方式中，該樣的支架是絲氨酸蛋白酶。在另一【具體實施方式】中，該樣的支架是半脫氨酸 蛋白酶。使用所需祀蛋白的所需底物序列，測定序列庫每個成員的斷裂活性。結果是，可W 測定出相對于所需的底物序列具有最高斷裂活性的蛋白酶。
[0010] 在此【具體實施方式】的另一方面，對于蛋白酶支架產生的變異數(shù)量可W是1、2- 5(例如 2、3、4 或者 5)，5-10(例如 5、6、7、8、9 或者 10)，或者 10-20(例如 10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、或者20)。
[0011] 在此【具體實施方式】的另一方面，公知的蛋白酶支架可W含有下述任一種微粒 的氨基酸序列：膜蛋白酶、膜凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、凝血酶（thrombin)、纖溶 酶（plasmin)、凝血因子Xa、尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase type plasminogen activator, uPA)、組織纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator, tPA)、膜型絲氨 酸蛋白酶-1 (MTSP-1)、粒酶B、粒酶M、彈性蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性白細胞彈性 蛋白酶、血漿激膚釋放酶、尿激酶型纖溶酶原激活物、補體因子絲氨酸蛋白酶、ADAMTS13、神 經(jīng)內膚酶/neprilysin、弗林蛋白酶、或者克魯?shù)鞍酌浮?br>[0012] 在此【具體實施方式】的另一方面，祀蛋白是與病癥有關的，例如，祀蛋白導致了病 癥。病癥可W是，例如類風濕性關節(jié)炎、敗血癥、癌癥、艾滋病、呼吸道感染、流行性感冒、屯、 血管疾病、或哮喘。
[0013] 在此【具體實施方式】的另一方面，與序列庫平均活性相比，測定的蛋白酶活性增長 了至少10倍、100倍、或者1000倍。
[0014] 本發(fā)明另一【具體實施方式】設及生成了用于篩選修飾蛋白酶的底物序列庫，從而測 定出哪種底物序列（組）是修飾蛋白酶最有效斷裂的底物序列（組）。序列庫成員是由隨 機氨基酸序列構成的，并且測定蛋白酶對于序列庫每個成員的斷裂活性。測定出蛋白酶最 有效斷裂的底物序列。
[0015] 此【具體實施方式】的另一個方面，底物序列是祀蛋白的一部分。此祀蛋白可W設及 病癥。例如，祀蛋白是造成病癥的一種蛋白。此【具體實施方式】的另一個方面，病癥可W是類 風濕性關節(jié)炎、敗血癥、癌癥、艾滋病、呼吸道感染、流行性感冒、屯、血管疾病、或哮喘。
[0016] 此【具體實施方式】的另一個方面，與序列庫平均活性相比、測定底物序列的斷裂效 率增長了至少10倍、至少100倍、或者至少1000倍。
[0017] 在另一【具體實施方式】中，本發(fā)明包括治療帶有病癥的患者。該種方法設及將斷裂 與病癥有關祀蛋白的蛋白酶給藥患者，W致斷裂祀蛋白治療病癥。
[0018] 此【具體實施方式】的一個方面，病癥可W是類風濕性關節(jié)炎、敗血癥、癌癥、艾滋病、 呼吸道感染、流行性感冒、屯、血管疾病、或哮喘。此【具體實施方式】的另一個方面，該樣的蛋白 酶可W是絲氨酸蛋白酶。在本發(fā)明的另一【具體實施方式】，該樣的修飾蛋白酶是半脫氨酸蛋 白酶。在此【具體實施方式】的另一方面，祀蛋白造成了病癥。
[0019] 帶有病癥的患者，例如由本發(fā)明方法治療的患者，可W是哺乳動物，或者更具體的 是一個人類。
[0020] 在此【具體實施方式】的另一方面，祀蛋白可W是腫瘤壞死因子受體、白介素-1、白介 素-1受體、白介素-2、白介素-2受體、白介素-4、白介素-4受體、白介素-5、白介素-5受 體、白介素-12、白介素-12受體、白介素-13、白介素-13受體、P選擇蛋白（p-selectin)、P 選擇蛋白糖蛋白配基（p-selectin glycoprotein ligand)、P物質、緩激膚、PSGL、凝血因子 IX、免疫球蛋白E、免疫球蛋白E受體、CC貼、CXCR4、糖蛋白120、糖蛋白41、CD4、血凝素、呼 吸道合胞病毒融合蛋白（respiratoiy syn巧tium virus fusion protein)、B7、CD28、CD2、 CD3、CD4、CD40、血管內皮生長因子、血管內皮生長因子