靈芝錳過氧化物酶畢赤酵母基因工程菌株構建及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及的是一種分子生物學、基因工程領域的技術，具體是一種畢赤酵母基 因工程菌株構建及其該菌株在生產鋪過氧化物酶中的用途。
【背景技術】
[000引鋪過氧化物酶（Manganese peroxida，Mn巧是一類糖蛋白，由一系列糖基化的含 有一個化(S)-化咐環(huán)（I幻血紅素輔基的同工酶組成，等電點4. 2~4. 5,真菌產生的MnP 分子量在38~62. 5kDa，大多數純化酶的分子量大約在45kDa左右，其酶活中屯、是由一 個血紅素基和一個Mn2+構成，還有兩個起穩(wěn)定結構作用的化 2+，其分子由十條長的蛋白質 單鏈和一條短的單鏈構成。其活性不僅依賴于&化，還依賴于Mn"的存在，在離體條件下 能分解芳香環(huán)多聚體狂hou XW，Cong WR，Su KQ，化ang YM. Li即inol}ftic enzymes from Ganoderma spp. - Current status and potential applications. Critical Reviews in Microbiology. 2013,39(4) :416 - 26);因而具有極高的工業(yè)應用潛力，可在生物制漿、紙 漿的酶法漂白、有機污染物的降解和環(huán)境的生物修復等方面得到有效的應用，另外在褐煤 的生物轉化過程中起重要的作用，可減少能源浪費和環(huán)境污染（王舊，王圓，周曉云，蘆國 營.鋪過氧化物酶（Mn巧的研究進展.化工技術與開發(fā).2005, 34(4) : 28 - 31)。MnP被認 為是降解木質素和異生芳香化合物的關鍵酶化akalaa T K，Lundella T，Ga化ina S，et al. Manganese Peroxidases，Laccases and oxalic acid from the selective white -rot fungu Physisporinus rivulosus grown on spruce wood chips. Enzyme and Microbial Technology, 2005,36:461 - 468)，尤其在染料脫色方面。
[0003] 天然的MnP主要來自于真菌，目前已知產MnP的58種真菌主要是一些白腐真菌， 多屬擔子菌亞口、無隔擔子菌亞綱、無權菌目的多孔菌科（趙±豪，趙學庫，楊麗寧.鋪依賴 過氧化物酶研究進展.安徽農業(yè)科學，2007,35(4) ;957 -95)。在MnP降解異生芳香化合物 的研究中，前人研究證明，在W MnP為主要木質素酶的脫色體系中，香茹Lentinula edodes 對染料剛果紅、RBBR、Poly R -478、臺盼藍、己基紫和甲基綠的脫色率達到92. 0% -98. 0% ; 白腐真菌菌株L -25及其MnP對多種偶氮、蔥釀類染料的脫色率達到84. 9%-99. 6%;在原毛 平革菌屬的化anerochaete sordida對活性艷藍、活性艷澄、活性艷紅、活性深綠4種染料 混合液的脫色過程中，MnP起主要作用，脫色率達到90.0% (李旭東，英榮，程曉濱，等.鋪 過氧化物酶的固態(tài)發(fā)酵及其對染料的脫色作用.環(huán)境科學學報，2008,28(3) :490 -495)。呂 聰等報道了鋪過氧化物酶對染料剛果紅的最佳脫色條件，并利用多孔菌科真菌巧等化ria cocos在液體發(fā)酵條件下產鋪過氧化物酶，并對其用于染料結晶紫降解脫色進行了研究 (呂聰，曹福祥，董旭杰.鋪過氧化物酶對染料剛果紅脫色工藝條件的初探.造紙化學品與 應用.2008,（2): 17-18.呂聰，曹福祥，董旭杰.鋪過氧化物酶對結晶紫脫色的研究.中 南林業(yè)科技大學學報.2008, 28 (3) : 172 - 174)。目前，木質素酶（包括Mn巧的研究大多利 用合成培養(yǎng)基進行液態(tài)發(fā)酵，需添加昂貴的誘導物襲蘆醇等，并且發(fā)酵周期長、成本高、酶 活低。20世紀90年代，固態(tài)發(fā)酵開始受到重視.固態(tài)發(fā)酵可模擬白腐真菌的自然生長環(huán) 境，與液態(tài)發(fā)酵相比產量更高、操作更簡單、成本也更低（李旭東，英榮，程曉濱，等.鋪過氧 化物酶的固態(tài)發(fā)酵及其對染料的脫色作用.環(huán)境科學報，2008,28(3) :490 - 495)。但固態(tài) 發(fā)酵酶的分離純化成本較高，增加了進行環(huán)境修復的成本。
[0004] 隨著生物技術的發(fā)展，基因克隆和表達技術的不斷完善，MnP基因已經被成功克隆 并實現(xiàn)了異源表達和同源表達。在原核生物中，MnP基因的表達產物為無血紅素插入的、 無酶活性的包含體；利用桿狀病毒表達系統(tǒng)對黃抱原毛平革菌P. C虹ysosporium的MnP基 因進行表達，得到的重組蛋白與原蛋白具有相同的酶活，表明其翻譯后修飾是正確有效的， 當培養(yǎng)液中加人Ig/mL的血紅素時，MnP的活力提高，但MnP的產量并未提高。在酵母菌 P. pastoris中，黃抱原毛平革菌P. C虹ysosporium中的MnP基因也得到成功表達，但血紅 素為MnP酶活的限制性因素，未曾見有有關酶活的報道。酵母菌是一種單細胞真菌類微生 物，它既具有單細胞細菌生長快、易于操作的特點，又能像絲狀真菌那樣抵御不良的生長環(huán) 境，因此，它易于培養(yǎng)、適合運用于環(huán)境治理。盡管如此，構建MnP基因工程酵母菌，并利用 含有MnP基因工程酵母菌進行含有偶氮染料的工業(yè)廢水處理等方面應用仍未見報道?，F(xiàn)有 技術存在W下幾個主要的缺點；一是脫色作用大都是通過菌體對染料的吸附作用實現(xiàn)的， 不能將染料進一步降解和徹底礦化；二是缺乏高效的降解菌株；大多數單株菌落的廣譜性 較差，只能作用少數結構簡單的染料分子；并且脫色速率不能滿足實際廢水的處理要求。= 是對環(huán)境的適應性不強。大多數菌株的耐鹽性或耐堿性不強，在高鹽濃度下菌體的生長能 力和脫色降解能力迅速降低。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有利用MnP對廢水中偶氮染料脫色技術中存在的不足，提出一種靈 芝鋪過氧化物酶畢赤酵母基因工程菌株構建及應用，通過分子生物學技術從白腐真菌靈芝 中克隆鋪過氧化物酶基因（GlMn巧、構建含鋪過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母表達載 體PA0815 -GlMnP，將上述構建的畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母（P. pastoris) SMD1168H， 并通過氨節(jié)青霉素（Ampicillin，Amp)抗性篩選獲得表達載體高拷貝重組的含鋪過氧化物 酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌（SMD1168H-GlMn巧。本發(fā)明通過工業(yè)方式制備工程菌 并量產生物酶，能夠應用于脫除生產、污水等體系偶氮染料，如對紡織工業(yè)廢水、印染工業(yè) 廢水及其與染料生產和使用相關的工業(yè)廢水的脫色。
[0006] 本發(fā)明是通過W下技術方案實現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明設及一種鋪過氧化物酶基因GlMnP的表達方法，通過從靈芝中克隆出鋪過 氧化物酶基因GlMnP，經化ndin和EcoRI雙酶切后克隆入畢赤酵母表達質粒并構建出表達 載體，最后將其轉化入畢赤酵母表達宿主菌中，經培養(yǎng)擴增和篩選后得到畢赤酵母工程菌。 [000引所述的鋪過氧化物酶基因GlMnP的核巧酸序列如Seq ID. No. 1所示。
[0009] 所述的靈芝，即靈芝菌種佑.lucidum 50044)，購自中國普通微生物菌種保藏管理 中屯、（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)。
[0010] 所述的雙酶切是指；將擬表達的靈芝鋪過氧化物酶基因GlMnP的cDNA序列經 Hindlll 和 EcoRI 雙酶切。
[0011] 所述的畢赤酵母表達質粒優(yōu)選為經過相同的所述Hindlll和EcoRI雙酶切的質 粒，進一步優(yōu)選為pA0815。
[0012] 所述的轉化優(yōu)選采用電轉化方式。
[0013] 所述的畢赤酵母表達宿主菌優(yōu)選為畢赤酵母SMD1168H
[0014] 所述的培養(yǎng)擴增是指；將經過轉化作用的畢赤酵母細胞涂布于含Amp濃度為 2. Omg/mL的MD瓊脂平板30°C培養(yǎng)3天，然后挑取轉化子進行PCR擴增檢測。
[0015] 所述的篩選是指；篩選高拷貝重組了鋪過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母重組 子作為含鋪過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌，即重組畢赤酵母陽性菌株。
[0016] 本發(fā)明設及上述