利用木材水解液制備微生物油脂的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領域，尤其涉及一種利用木材水解液制備微生物油脂的方法。
【背景技術】
[0002]傳統(tǒng)的能源物質煤、石油及天然氣的大量消耗使得尋找可替代的再生能源日益緊迫。生物質能是太陽能以化學能形式貯存在生物質中的能量形式，在整個能源系統(tǒng)中占有重要地位，它直接或間接地來源于綠色植物的光合作用，是一種可再生的綠色能源。木質生物質能是生物質能的重要組成部分。中國陸地林木生物質資源總量在180億噸以上，但長期以來直接燃燒一直是我國對木質生物質能源的主要利用方式。近年來，木質生物質能源的研宄和應用有了快速發(fā)展，不僅可應用于制漿造紙工業(yè)，也可替代有限的石化資源用于生產(chǎn)化學品、合成材料和再生能源等。然而，木質生物質結構復雜，纖維素，半纖維素與木質素緊密結合，相互纏繞，嚴重制約了其轉化效率。預處理技術作為生物質精煉高效轉化的關鍵步驟，已成為世界各國的研宄熱點。其中，熱水預處理是分離半纖維素的一種有效方法，木質生物質以水作為反應介質，高溫高壓下半纖維素中的乙?；厶轻尫懦鲆宜幔瑢е掳肜w維素聚糖溶出，聚糖可不同程度分解為葡萄糖，木糖，甘露糖，半乳糖等。已有研宄者將水解液中的半纖維素衍生糖類進行微生物發(fā)酵制取乙醇等化學物質。
[0003]生物柴油是一種可再生的油脂原料，由動物脂肪，植物油脂和微藻，通過其與醇類(如甲醇)在催化劑作用下合成的長鏈脂肪酸甲酯類物質。然而，生物柴油制備過程受油料供給成本制約，難以滿足日益擴大的市場需求。采用廉價原料降低成本，是生物柴油能否實用化的關鍵。因此，開發(fā)新型的油脂生產(chǎn)方式成為未來重要的發(fā)展方向之一。近年來，來自于產(chǎn)油微生物的單細胞油脂(SCOs)作為生物柴油油脂原料的來源已經(jīng)收到廣泛關注。利用微生物油脂生產(chǎn)生物柴油具有微生物生長周期短，產(chǎn)量高及油脂成分與植物油相似等優(yōu)點。目前，液態(tài)發(fā)酵是微生物油脂的主要工業(yè)生產(chǎn)方式，其碳源主要來自于糧食作物。這種方法生產(chǎn)成本高昂，已成為微生物油脂發(fā)展的阻礙之一。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有微生物油脂生產(chǎn)碳源原料成本過高的技術問題，提供一種價格低廉的原料用于可應用于生物柴油的微生物油脂的生產(chǎn)。
[0005]為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案如下:
提供一種用木材水解液制備微生物油脂的方法，包括以下步驟:
51、將木材進行熱水處理得到木材水解液；
52、將所述木材水解液去毒，在去毒后的木材水解液中添加鹽分，調節(jié)pH值為7?9，滅菌，制備成培養(yǎng)基；
53、在所述培養(yǎng)基中接入產(chǎn)油脂菌的種子液，發(fā)酵得到發(fā)酵液；
54、取所述發(fā)酵液中的菌體進行油脂交換反應得到微生物油脂。
[0006]上述的方法，優(yōu)選的，步驟S3中發(fā)酵時間為32?56 h。
[0007]上述的方法，優(yōu)選的，所述SI步驟中所述熱水處理步驟具體為:將木材與水按照固液比為1: 5?8混合，在150?200°C條件下反應30?120 min。
[0008]上述的方法，優(yōu)選的，所述S2步驟中所述去毒步驟包括以下步驟:
S2-1、石灰法:在所述木材水解液中添加Ca (OH)2,使pH為10?12，I h過濾取濾液，得到堿性木材水解液；在所述堿性木材水解液中加入H2SO4調節(jié)pH為5?6，I h過濾取濾液，得到酸性木材水解液；在所述酸性木材水解液中加入Na2SO3,在100°C反應10?20 min,過濾得到濾液。
[0009]S2-2、吸附法:在所述步驟S2-1制備得到的濾液中添加吸附樹脂，進行震蕩吸附8?12 h，完成去毒步驟。上述的方法，優(yōu)選的，所述S2-2步驟中，所述吸附樹脂為Amberlite XAD-4，所述吸附樹脂與所述濾液的質量體積比為1: 4?6 ;所述震蕩吸附反應的溫度為25?35°C，轉速為100?160 rpm。
[0010]上述的方法，優(yōu)選的，所述鹽分包括0.5?I g/L的(NH4) 2S04、0.5?1.5 g/L的MgSO4.7Η20、0.010 ?0.015 g/L 的 CaCl2.2Η20、0.5 ?1.5 ml/L 的微量元素液、0.5 ?1.5ml/L的Stock A溶液和30?40 ml/L的磷酸鹽緩沖液。
[0011]上述的方法，優(yōu)選的，所述微量元素液包括0.3?0.6 g/L的FeSO4.7H20、0.3?0.5 g/L 的ZnSO4.7Η20、0.01 ?0.02 g/L 的MnSO4.Η20、0.010 ?0.020 g/L 的H3BO3、0.005 ?0.015 g/L 的 NiCl2.6Η20、0.20 ?0.25 g/L 的 EDTA、0.04 ?0.06 g/L 的 CoCl2.6H20、0.004 ?0.006 g/L 的 CuCl2.2Η20 ;所述 Stock A 溶液包括 1.5 ?2.5 g/L 的 NaMoO4.2Η20及4.0?5.0 g/L的乙二胺四乙酸鐵鈉；所述磷酸鹽緩沖液包括110?115 g/L的Κ2ΗΡ04、45 ?48 g/L 的 ΚΗ2Ρ04。
[0012]上述的方法，優(yōu)選的，所述產(chǎn)油脂菌為渾池紅球菌(/Sot/ococciAs opacus)。
[0013]上述的方法，優(yōu)選的，所述木材包括針葉材(如松木)和闊葉材(如楓香木)。
[0014]上述的方法，優(yōu)選的，所述酯交換反應為:將菌體、有機溶劑和催化劑混合，萃取收集有機相，得到所述微生物油脂。
[0015]上述的方法，優(yōu)選的，所述有機溶劑為氯仿和甲醇混合溶液，所述催化劑為濃硫酸；所述菌體、氯仿、甲醇的質量體積比為10 mg: 2?5 mL:1?4.5 mL。
[0016]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
(I)本發(fā)明采用了木質生物質為原料，將其通過熱水處理制備水解液，將水解液通過微生物發(fā)酵的方法轉化為微生物油脂并作為生物柴油應用的油脂原料，不僅為微生物油脂生產(chǎn)提供了一種經(jīng)濟的原料來源，同時拓展了木質生物質熱水預處理水解液利用的新途徑，操作簡單，成本低廉。
[0017](2)本發(fā)明采用渾濁紅球菌作為發(fā)酵菌種，易培養(yǎng)，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)油量較高，油脂分布隨著木質纖維素原材料種類及生長條件不同而變化，在一定程度上可調控生產(chǎn)具有一定特性的微生物油脂。
[0018](3)我國林木資源豐富，本發(fā)明采用木材作為熱水預處理原料(包括針葉材和闊葉材)，進一步發(fā)展了中國林木生物質能源的應用潛力。
【附圖說明】
[0019]為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整的描述。
[0020]圖1為實施例1中渾濁紅球菌PD630在松木水解液中的細菌生長及油脂積累隨時間的變化示意圖。
[0021]圖2為實施例2中渾濁紅球菌DSM 1069在松木水解液中的細菌生長及油脂積累隨時間的變化示意圖。
[0022]圖3為實施例3中渾濁紅球菌PD630在楓香木水解液中的細菌生長及油脂積累隨時間的變化情況示意圖。
【具體實施方式】
[0023]以下結合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護范圍。
[0024]以下實施例中Amberlite XAD-4購于Sigma-Aldrich, USA ;產(chǎn)油脂菌為渾池紅球HRhodococcus菌株編號為 DSM 44193 (PD 630)或 DSM 1069，均購于德國微生物菌種保藏中心，網(wǎng)址為WWW.dsmz.de。
[0025]實施例1
本發(fā)明利用木材水解液制備微生物油脂的方法，采用木材為針葉材，具體為松木材；采用的產(chǎn)油脂菌為渾池紅球菌(熱ot/ococciAs opacus) PD 630，菌株編號為DSM 44193。
[0026]具體包括以下步驟:
Cl)熱水處理:將松木切片，粉碎得到松木材粉末。稱取10g的松木材粉末，加入800ml去離子水，混合均勻，放入反應釜中，以180°C溫度下反應I h (在150?200°C條件下反應30?120 min也可實施)，取出過濾，收集濾液得到木材水解液。
[0027](2)去毒:
2.1、在步驟(I)中制備得到的木材水解液中添加Ca (OH) 2，使pH為10，I h后將水解液過濾取濾液得到堿性木材水解液；在堿性木材水解液中加入2 M的H2SO4,調節(jié)pH為5.5，I h后再次過濾取濾液，得到酸性木材水解液；在木材水解液中加入0.1 g/L Na2SO3, 100C下反應15 min，然后冷卻至室溫，過濾取濾液。
[0028]2.2、在步驟2.1制備得到的濾液中按照固液比為Ig: 4ml添加吸附樹脂Amberlite XAD-4得到混合液，將混合液置于30°C，160 rpm條件下震蕩8 h，再次過濾得到去毒后的木材水解液。
[0029](3)配制培養(yǎng)基:在去毒后的木材水解液中添加鹽分，調節(jié)pH值為7.5 (pH為7?9均可實施)，滅菌，制備成培養(yǎng)基。
[0030]步驟(3)中，鹽分具體為0.5 g/L 的(NH4)2SCV0.5 g/L 的 MgSO4.7H20、0.010 g/L的CaCl2.2Η20、0.5 ml/L的微量元素液、0.5 ml/L的Stock A溶液和30 ml/L的磷酸鹽緩沖液。
[0031]其中微量元素液包括0.3 g/L 的 FeSO4.7H20、0.3 g/L 的 ZnSO4.7Η20、0.01 g/L的 MnSO4.Η20、0.010 g/L 的 H3BO3、0.005 g/L 的 NiCl2.6Η20、0.20 g/L 的 EDTA、0.04 g/L的 CoCl2.6Η20、0.004 g/L 的 CuCl2.2H20。
[0032]Stock A溶液包括1.5 g/L的NaMoO4.2H20及4.0 g/L的乙二胺四乙酸鐵鈉。
[0033]磷酸鹽緩沖液包括110 g/L 的 K2HP04、45 g/L 的 ΚΗ2Ρ04。
[0034](4)發(fā)酵:在步驟(3)制備得到的培養(yǎng)基中按照體積百分含量添加1%的PD630種子液，在30°C，150 rpm條件下震蕩培養(yǎng)72 h得到發(fā)酵液(震蕩吸附反應的溫度為25?35°C，轉速為100?160 rpm均可實施)。
[0035](5)油脂交換反應:定時取樣收集發(fā)酵液中的菌體3.3mg，加入Iml氯仿，0.85 ml甲醇，0.15 ml濃硫酸反應萃取后收集有機相，得到微生物油脂。
[0036]將實施例1中制備得到的微生物油脂進行氣相色譜-質譜聯(lián)用儀的分析，分析結果參見圖1。由圖1可知，48 h可得到最大產(chǎn)油量，為0.21 g/L，細菌油脂含量為24.8%。
[0037]實施例2
本發(fā)明利用木材水解液制備微生物油脂的方法，采用木材為針葉材，具體為松木；采用的產(chǎn)油脂菌為渾池紅球菌(TPAot/ococciAs菌株編號為DSM 1069。
[0038](I)熱水處理:將松木切片，粉碎得到松木材粉末。稱取150g的松木材粉末，加入800 ml去離子水，混合均勻，放入反應釜中，以200 °C溫度下反應I h (在150?200°C條件下反應30?120 min也可實施)，取出過濾，收集濾液得到木材水解液。
[0039](2)去毒:
2.1、在步驟(I)中制備得到的木材水解液中添加Ca (OH) 2,使pH為11，I h后將水解液過濾取濾液得到堿性木材水解液；在堿性木材水解液中加入2 M的H2SO4,調節(jié)pH為5，Ih后再次過濾取濾液，得到酸性木材水解液；在木材水解液中加入0.1 g/L Na