一種用于真菌Oidiodendron truncatum生產(chǎn)新型抗腫瘤活性化合物chetracin B的新型 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及發(fā)酵培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，更為具體的，涉及到用于培養(yǎng)真菌Oid1dendron truncatum的培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，尤其是指一種用于真菌Oid1dendrontruncatum生產(chǎn)新型抗腫瘤活性化合物chetracin B的新型培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]天然產(chǎn)物不僅是創(chuàng)新藥物的直接來(lái)源，而且可以為化學(xué)合成提供重要的活性骨架模板和結(jié)構(gòu)信息，大大提高新藥發(fā)現(xiàn)的幾率，因而尋找和發(fā)現(xiàn)具有高活性、新靶點(diǎn)的骨架新穎的天然產(chǎn)物在現(xiàn)代藥物研宄中發(fā)揮著不可替代的作用。真菌天然產(chǎn)物是結(jié)構(gòu)多樣性和活性多樣性的重要來(lái)源。近年來(lái)，研宄者開(kāi)始將目光轉(zhuǎn)移到一些特殊生境來(lái)源的真菌，如極地、深海、鹽湖、海洋動(dòng)植物共附生等。
[0003]chetracin B 是本研宄室從南極來(lái)源真菌 Oid1dendron truncatum GW3-13 中分離出來(lái)的一種高活性新型的含多硫鍵的哌嗪類(lèi)化合物(朱天驕，顧謙群第，一種含多硫鍵的哌嗪類(lèi)化合物及其制備方法和用途，ZL201010119068.3)。細(xì)胞活性測(cè)試表明，其對(duì)BGC-823人胃癌細(xì)胞、BEL-7402人肝癌細(xì)胞、HCT-8人結(jié)直腸癌細(xì)胞、A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、A2780人卵巢癌細(xì)胞的IC5tl分別為0.011,0.003,0.013,0.022,0.028 μ Mo在分子水平上該化合物具有 HIF-1 α 抑制活性(Liyuan Li，Dehai Li，Yepeng Luan, Qianqun Gu,and Tianjiao Zhu.Cytotoxic Metabolites from the Antarctic Psychrophilic FungusOid1dendron truncatum, J.Nat.Prod.，2012，75:920-927.)，具有很好的醫(yī)藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。
[0004]然而該化合物在初始發(fā)酵條件下產(chǎn)量較低(< 6mg.Γ1)，制約了對(duì)其進(jìn)一步的體內(nèi)外活性測(cè)試及動(dòng)物、臨床研宄，因此該化合物的產(chǎn)量成為了首要解決的問(wèn)題，所以需開(kāi)發(fā)一種促進(jìn)真菌Oid1dendron truncatum GW3-13生產(chǎn)chetracin B的培養(yǎng)基，為后期研宄提供一個(gè)必要的基礎(chǔ)條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的主要目的是針對(duì)上述存在的問(wèn)題與缺陷，提供一種用于真菌Oid1dendron truncatum GW3-13生產(chǎn)新型抗腫瘤活性化合物的新型培養(yǎng)基及其制備方法，該新型原料易得，成本較低，制備方法簡(jiǎn)單，能顯著促進(jìn)Oid1dendron truncatumGW3-13發(fā)酵生產(chǎn)chetracin B的產(chǎn)量，有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)Oid1dendrontruncatum GW3-13發(fā)酵研宄及chetracin B醫(yī)藥學(xué)研宄具有重大意義。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]一種用于Oid1dendron truncatum GW3-13生產(chǎn)新型抗腫瘤活性化合物的新型培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是，每升所述新型培養(yǎng)基包括:麥芽糖2?10g，蛋白胨0.5?5g，玉米粉I?1g,谷氨酸鈉0.5?10g，葡萄糖10?100g，酵母膏0.2?4g，七水硫酸鎂0.1?lg，磷酸二氫鉀0.1?3g，其余為去離子水。
[0008]較佳地，所述麥芽糖5g，蛋白胨1.5g，玉米粉3g，谷氨酸鈉4g，葡萄糖23.7g，酵母膏1.78g，七水硫酸鎂0.45g，磷酸二氫鉀0.5go
[0009]一種用于制備上述的新型培養(yǎng)基的方法，其特點(diǎn)是，所述麥芽糖，所述蛋白胨，所述玉米粉，所述谷氨酸鈉，所述葡萄糖，所述酵母膏，所述七水硫酸鎂，所述磷酸二氫鉀溶于去離子水，定容。
[0010]較佳地，上述步驟進(jìn)一步包括:在121°C，滅菌20?30min。
[0011]—種使用上述新型培養(yǎng)基培養(yǎng)南極來(lái)源真菌GW3-13生產(chǎn)chetracin B的發(fā)酵方法，其特點(diǎn)是，包括以下:取南極來(lái)源真菌GW3-13孢子接種所述新型培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)10?12天，獲得發(fā)酵液。
[0012]較佳地，按終濃度3-5*106個(gè)所述南極來(lái)源真菌GW3-13孢子/ml進(jìn)行接種；所述培養(yǎng)是在25°C，180r/min搖床培養(yǎng)。
[0013]—種上述發(fā)酵方法生產(chǎn)的chetracin B的檢測(cè)方法，其特點(diǎn)事，包括步驟:待所述發(fā)酵液變深灰黑色后約12h，停止培養(yǎng)；取適量所述發(fā)酵液，加入乙酸乙酯和玻璃珠萃取離心，取適量有機(jī)相進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸餾，餾干物用乙酸乙酯溶解，離心；取適量上層液，用HPLC測(cè)定chetracin B含量，然后換算所述發(fā)酵液中chetracin B含量。
[0014]較佳地，所述發(fā)酵液取20ml，所述乙酸乙酯40ml，所述玻璃珠5粒；所述萃取在25°C和150r/min條件下進(jìn)行。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)良效果具體如下:
[0016]1、由于本發(fā)明的新型培養(yǎng)基成分主要是麥芽糖、蛋白胨、玉米粉、谷氨酸鈉、葡萄糖、酵母膏、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀等常見(jiàn)物質(zhì)，易得，成分低；
[0017]2、制備本發(fā)明的新型培養(yǎng)基時(shí)，只需將各成分混合溶于去離子水即可，制備簡(jiǎn)單；
[0018]3、使用本發(fā)明的新型培養(yǎng)基培養(yǎng)該目的菌株時(shí)，該菌株在該新型培養(yǎng)基中可生長(zhǎng)良好，最終產(chǎn)量達(dá)到54.7mg/L，是原始水平的9.6倍，顯著的促進(jìn)了該菌株生產(chǎn)chetracinB的產(chǎn)量，有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)真菌Oid1dendron truncatum GW3-13發(fā)酵研宄及chetracin B醫(yī)藥學(xué)研宄具有重大意義。
【具體實(shí)施方式】
[0019]為了更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，一下結(jié)合實(shí)例作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0020]實(shí)施例1
[0021]1.1培養(yǎng)基配制
[0022]稱(chēng)取麥芽糖5g，蛋白胨1.5g，玉米粉3g，谷氨酸鈉4g，葡萄糖23.7g，酵母膏1.78g，七水硫酸鎂0.45g，磷酸二氫鉀0.5g，倒入煮沸的去離子水中充分溶解，最后用去離子水定容至1000ml。
[0023]1.2 發(fā)酵生產(chǎn) chetracin B:
[0024]南極來(lái)源真菌GW3-13(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號(hào)是CCTCC M2010043)，用無(wú)菌水從斜面沖洗下新鮮GW3-13孢子，按終濃度3-5*106個(gè)/ml接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于25oC,180r/min搖床培養(yǎng)10-12天，待發(fā)酵液變?yōu)樯罨液谏蠹s12h后，停止培養(yǎng)。
[0025]1.3chetracin B 產(chǎn)量的測(cè)定
[0026]取上一步驟制備的發(fā)酵液20ml，加入40ml乙酸乙酯和5粒玻璃珠，于25°C，150r/min萃取24h。10000r/min離心lOmin，取上層有機(jī)相，減壓旋轉(zhuǎn)蒸館?，飽干物用Iml乙酸乙醋溶解，用HPLC測(cè)定chetracin