-10為樣品3,11-12為樣品4,13-14為樣品5,15-16為樣品 6,17-18 為樣品 7)。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0024] 如無(wú)特殊說(shuō)明，W下實(shí)施例中的"％"均指質(zhì)量百分比。
[00巧]實(shí)施例1澳洲堅(jiān)果過(guò)敏原特異性恒溫?cái)U(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與篩選 根據(jù)澳洲堅(jiān)果特異基因序列化?設(shè)計(jì)3套恒溫?cái)U(kuò)增引物，每套引物中包括外引物1和 外引物2、內(nèi)引物1和內(nèi)引物2、環(huán)引物1和環(huán)引物2。引物篩選采用3套引物中的外引物和 內(nèi)引物進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，25 y L反應(yīng)體系如下： 外引物1和外引物2各511]\1、內(nèi)引物1和內(nèi)引物2各4〇11]\1、化^ 2.0 Warmstar DNA 聚合酶 8U、p服.8 的 Tris-肥 1 20 mM、KCl 10 ml、（NH4)2S04 10 mM、0. 1% Tween-20、dNTPs 1. 6mM、M拆〇4 0. 8mM、甜菜堿0. 8M，英光染料SYTO-910 y M、待檢樣品DM 2 y L，d地2〇補(bǔ)足 至 25 y L。
[002引反應(yīng)步驟如下： (1) 模板DM的制備：采用CTAB法提取純化澳洲堅(jiān)果標(biāo)準(zhǔn)品DM ; (2) 恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)；上述25 y L反應(yīng)體系混合后置于英光PCR儀中實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增 反應(yīng)，英光PCR儀反應(yīng)程序?yàn)?；Holding Stage為63C 30 s，l個(gè)循環(huán)；切cling Stage為 63°C 15 s，63°C 45 s，90個(gè)循環(huán)，于63°C 45 S處收集英光信號(hào)，英光通道為FAM。設(shè)置陰 性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ; (3) 結(jié)果判定：根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷結(jié)果，有"S"型擴(kuò)增曲線的為陽(yáng)性，無(wú)"S"型擴(kuò)增曲 線的為陰性。
[0027] 檢測(cè)結(jié)果見圖1，本實(shí)施例中第一套引物70 min后出現(xiàn)擴(kuò)增，第二套引物出峰時(shí) 間約在35 min,第H套引物出峰時(shí)間約40 min。出峰較早的第二套引物為最優(yōu)引物組。
[0028] 第二套檢測(cè)引物組包括外引物1和外引物2、內(nèi)引物1和內(nèi)引物2,環(huán)引物1和環(huán) 引物2,其核巧酸序列分別如下所示： 外引物 1 ;GTGAGTCAGTGCGATAAGAG (SEQ ID No ;1); 外引物 2 ; TCATATCTCCTCTCGCAGC (SEQ ID No ;2); 內(nèi)引物 1 ;TGGCAGTATTGTTGCTGACGTGATCCTCAGACGGAATGC (沈Q ID No ;3); 內(nèi)引物 2;ACGACGCTGCAAGGAAATATGTTGACATTGCTCGTATTGCT (沈Q ID No;4)。
[0029] 環(huán)引物 1 ;ATCGCCTCTGGCATTGTT (沈Q ID No ;5); 環(huán)引物 2 ;CCGACAACGTGATCCACA (沈Q ID No ;6)。
[0030] 實(shí)施例2澳洲堅(jiān)果過(guò)敏原的恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化 采用上述特異性恒溫?cái)U(kuò)增引物SEQ ID NO: 1~6，W Mg2+濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度 和反應(yīng)溫度4個(gè)條件為變量參數(shù)，對(duì)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化： (1) Mg"濃度優(yōu)化：設(shè)置4個(gè)Mg"濃度梯度依次為0. 4mM、0. 6mM、0. 8mM、1. OmM ; (2) 甜菜堿濃度優(yōu)化；設(shè)置4個(gè)甜菜堿濃度梯度依次為0. 6M、0. 8M、1. 0M、1. 2M ; (3) dNTPs濃度優(yōu)化：設(shè)置4個(gè)dNTPs濃度梯度依次為1. 2mM、1. 4mM、1. 6mM、1. 8mM ; (4) 反應(yīng)溫度優(yōu)化：設(shè)置4個(gè)反應(yīng)溫度梯度依次為63°C、64°C、65°C。
[0031] 在反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，采用反應(yīng)曲線的出峰時(shí)間作為評(píng)價(jià)的指標(biāo)，對(duì)上述參數(shù)進(jìn)行比較。 得出最優(yōu)的恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系如下： 25yL反應(yīng)體系；外引物1和外引物2各5yM、內(nèi)引物1和內(nèi)引物2各40yM、環(huán)引物 1 和環(huán)引物 2 各 20 y M、化^ 2. 0 Warmstar DNA 聚合酶 8U、9服.8 的 Tris-肥！ 20 ml、KC1 10 ml、（NH4)2S04 10 mM、0.1% Tween-20、dNTPs 1.6mM、M拆〇4 0.8mM、甜菜堿 0.8M，英光染 料SYTO-9 10 y M、待檢樣品DM 2 y L，d地2〇補(bǔ)足至25 y L。
[0032] 恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)程序有曲線法和顯色法兩種： 曲線法出olding Stage 為 63°C 30 s，l 個(gè)循環(huán)；切cling Stage 為 63°C 15 s，63°C 45 s，45個(gè)循環(huán)，于63°C 45 s處收集英光信號(hào)，英光通道為FAM。根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷結(jié)果， 有"S"型擴(kuò)增曲線的為陽(yáng)性，無(wú)"S"型擴(kuò)增曲線的為陰性。
[0033] 顯色法；將反應(yīng)管置于63°C反應(yīng)45min后，加入2uL lOOOXGeneFinder英光染 料，根據(jù)顏色判斷結(jié)果，陽(yáng)性為綠色，陰性為澄色。
[0034] 按上述優(yōu)化后條件檢測(cè)澳洲堅(jiān)果，檢出時(shí)間在12 min左右，檢測(cè)時(shí)間可定為 45min。
[00巧]實(shí)施例3靈敏度檢測(cè) 將澳洲堅(jiān)果標(biāo)準(zhǔn)品制備成質(zhì)量濃度分別為100%，10%，5%，1%，0. 5%，0. 1%，0. 05%的待檢 樣品進(jìn)行檢測(cè)。
[0036] CTAB法提取純化待檢樣品中的DNA，然后采用實(shí)施例2的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果判 斷方法有兩種，曲線法：有"S "型擴(kuò)增曲線的為陽(yáng)性，無(wú)"S "型擴(kuò)增曲線的為陰性，見圖3 ; 顯色法；若顯現(xiàn)綠色則為陽(yáng)性，澄色則為陰性，見圖4。
[0037] 本實(shí)施例中，曲線法和顯色法均可檢出100%、10%、5%、1%、0. 5%的澳洲堅(jiān)果陽(yáng)性樣 品，不能檢出0. 1%和0. 05%的陽(yáng)性樣品，兩種方法結(jié)果相一致。
[003引實(shí)施例4特異性實(shí)驗(yàn) 采用實(shí)施例2的方法對(duì)下面17種樣品進(jìn)行檢測(cè)，采用CTAB法提取純化待檢樣品DM， 設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(澳洲堅(jiān)果標(biāo)準(zhǔn)品）和陰性對(duì)照（d地20):
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種澳洲堅(jiān)果過(guò)敏原的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，包括以下步驟： 1) 根據(jù)澳洲堅(jiān)果過(guò)敏原基因設(shè)計(jì)特異性恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物； 2) 待檢樣品DNA在上述引物、2. O Warmstar DNA聚合酶存在的條件下進(jìn)行恒溫 擴(kuò)增反應(yīng)； 3) 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷待檢樣品中是否存在澳洲堅(jiān)果過(guò)敏原成分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物的序列分別 如下所示： 外引物 I :GTGAGTCAGTGCGATAAGAG (SEQ ID No :1); 外引物 2 :TCATATCTCCTCTCGCAGC (SEQ ID No :2); 內(nèi)引物 I :TGGCAGTATTGTTGCTGACGTGATCCTCAGACGGAATGC (SEQ ID No :3); 內(nèi)引物 2 :ACGACGCTGCAAGGAAATATGTTGACATTGCTCGTATTGCT (SEQ ID No :4); 環(huán)引物 I :ATCGCCTCTGGCATTGTT (SEQ ID No :5); 環(huán)引物 2 :CCGACAACGTGATCCACA (SEQ ID No :6)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟2)所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的 體系為：25yL反應(yīng)體系中含有外引物1和外引物2各2~10 μ M、內(nèi)引物1和內(nèi)引物2各 20~60 μ Μ、環(huán)引物1和環(huán)引物2各5~20 μ M、fci 2. 0 Warmstar DNA聚合酶5~10 U、 ρΗ8· 8 的 Tris-HCl 20 mM、KCl 8 ~12 mM、（MM)2SO4 8 ~12 mM、0. 08 ~0· 12% Tween-20、 dNTPs L 5 ~L 7mM、MgSO4 0· 6 ~L OmM、甜菜堿(λ 7 ~(λ 9M，待檢樣品 DNA 2 μ L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟2)所示恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的體系為： 25yL反應(yīng)體系中含有外引物1和外引物2各5μΜ、內(nèi)引物1和內(nèi)引物2各40μΜ、環(huán)引物 1 和環(huán)引物 2 各 20 μ M、2. 0 Warmstar DNA 聚合酶 8U、ρΗ8· 8 的 Tris-HCl 20 mM、KCl 10 mM、（MM)2SO4IO mM、0.1% Tween-20、dNTPs 1.6mM、MgSO4 0.8mM、甜菜堿 0.8M，待檢樣 品 DNA 2 μ L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟2)所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?63~65°C恒溫反應(yīng)45~60min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟3)可采用曲線法或顯色法判斷 擴(kuò)增結(jié)果，曲線法：在反應(yīng)體系中恒溫加入1-20 μ M SYT0-9使用熒光PCR儀或其它恒溫?zé)?光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷結(jié)果，有"S"型擴(kuò)增曲線的為陽(yáng)性，無(wú)"S"型擴(kuò)增曲 線的為陰性；顯色法：在反應(yīng)體系中加入500-2000XGeneFinder，根據(jù)顏色判斷結(jié)果，陽(yáng)性 為綠色，陰性為橙色。
7. -種用于檢測(cè)澳洲堅(jiān)果過(guò)敏原的恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒，其包括6條根據(jù)澳洲堅(jiān)果過(guò)敏原 基因設(shè)計(jì)特異性恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物的序列分別如 下所示： 外引物 I :GTGAGTCAGTGCGATAAGAG (SEQ ID No :1); 外引物 2 : TCATATCTCCTCTCGCAGC (SEQ ID No :2); 內(nèi)引物 I :TGGCAGTATTGTTGCTGACGTGATCCTCAGACGGAATGC (SEQ ID No :3); 內(nèi)引物 2 :ACGACGCTGCAAGGAAATATGTTGACATTGCTCGTATTGCT (SEQ ID No :4); 環(huán)引物 I :ATCGCCTCTGGCATTGTT (SEQ ID No :5); 環(huán)引物 2 :CCGACAACGTGATCCACA (SEQ ID No :6)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括以下組分： 2.0 Warmstar DNA聚合酶、ρΗ8·8 的Tris-HCl、KCl、（NH4)2S04、Tween-20、dNTPs、MgS0 4、 甜菜堿、GeneFinder或SYT0-9、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為澳洲堅(jiān)果標(biāo)準(zhǔn)品或 含有澳洲堅(jiān)果過(guò)敏原基因的重組質(zhì)粒,所述陰性對(duì)照品為ddH20。
10. -組用于檢測(cè)澳洲堅(jiān)果過(guò)敏原的特異性恒溫?cái)U(kuò)增引物，其序列分別如下所示： 外引物 I :GTGAGTCAGTGCGATAAGAG (SEQ ID No :1); 外引物 2 : TCATATCTCCTCTCGCAGC (SEQ ID No :2); 內(nèi)引物 I :TGGCAGTATTGTTGCTGACGTGATCCTCAGACGGAATGC (SEQ ID No :3); 內(nèi)引物 2 :ACGACGCTGCAAGGAAATATGTTGACATTGCTCGTATTGCT (SEQ ID No :4); 環(huán)引物 I :ATCGCCTCTGGCATTGTT (SEQ ID No :5); 環(huán)引物 2 :CCGACAACGTGATCCACA (SEQ ID No :6)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種澳洲堅(jiān)果過(guò)敏原的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物、試劑盒及方法。本發(fā)明方法基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，根據(jù)澳洲堅(jiān)果的特異性靶基因序列AMP2設(shè)計(jì)6條特異性引物，在具有鏈置換活性的Bst2.0WarmStarDNA聚合酶作用下，在63～65℃對(duì)核酸擴(kuò)增45～60min，擴(kuò)增效率可以達(dá)到109～1010個(gè)拷貝數(shù)。該方法具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡(jiǎn)便、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104630333
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310563936
【發(fā)明人】劉津, 張雋, 李志勇, 何日榮, 李婷, 凌莉, 劉青, 席靜, 關(guān)麗軍
【申請(qǐng)人】廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2013年11月14日