非小細(xì)胞型肺癌標(biāo)志物fam107a及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明設(shè)及非小細(xì)胞型肺癌標(biāo)志物 FAM107A及所述標(biāo)志物在制備非小細(xì)胞型肺癌輔助診斷或者預(yù)后制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤流行病學(xué)資料顯示，肺癌己成為目前癌癥死亡的首要原因，其總發(fā)病率在世 界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。2000年全球每年新診斷的肺癌病例達(dá)120萬(wàn)，占惡性腫瘤總發(fā)病率 的12.3%。在己確診的肺癌患者中，非小細(xì)胞肺癌（NS化C)患者占了 80-85%。大約70% 的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)己經(jīng)是mb期或者IV期。然而非小細(xì)胞肺癌診療水平的提高遠(yuǎn)落后于發(fā)病 率的上升，絕大多數(shù)患者就診時(shí)己屬晚期，失去手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，非小細(xì)胞肺癌術(shù)后5年生 存率在I期患者為70%，而Ilia期則降低至30% W下。從國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展來(lái)看，早期診 斷、早期治療是提高肺癌治療效果、降低死亡率的首選策略，而如何早期診斷肺癌，如何尋 找肺癌化療過(guò)程中誘導(dǎo)耐藥的關(guān)鍵機(jī)制，是目前迫切需要解決的問(wèn)題。
[000引轉(zhuǎn)錄組學(xué)是研究活細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所含信使RNA (Messenger RNA，mRNA)的 類型和拷貝數(shù)，反應(yīng)了某一特定時(shí)間和空間細(xì)胞內(nèi)所有基因的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)反應(yīng) 了細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)，不同生理、病理狀態(tài)下W及不同細(xì)胞類型都具有細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄 組，了解轉(zhuǎn)錄組是解讀細(xì)胞的分子功能、組成成分及其完成的生物過(guò)程所必需的，對(duì)我們理 解生命體機(jī)體發(fā)育、疾病發(fā)生與預(yù)防都具有重要作用。
[0004] 本發(fā)明對(duì)已發(fā)表的非小細(xì)胞型肺癌高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析，獲得1063 個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)水平上調(diào)的基因464個(gè)，表達(dá)水平下調(diào)的基因599個(gè)，并利用 KEGG、GO、OMIM等各種生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)和MATLAB等分析工具對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分 析，進(jìn)而篩選出影響肺腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因和重要的信號(hào)通路，另外基于數(shù)據(jù)挖掘分 析的結(jié)果，篩選出候選基因FAM107A，并進(jìn)一步采用分子生物學(xué)方法證實(shí)了 FAM107A基因與 非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系；FAM107A與非小細(xì)胞肺癌具有很好的相關(guān)性，可用于制備非小細(xì)胞 肺癌輔助診斷或者預(yù)后制劑，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供了非小細(xì)胞型肺癌致病相關(guān)基因FAM107A。
[0006] 本發(fā)明目的是提供了一種非小細(xì)胞型肺癌檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒檢測(cè) FAM107A基因。進(jìn)一步的，所述的試劑盒還包括其他檢測(cè)試劑。
[0007] 進(jìn)一步，所述的檢測(cè)試劑盒為檢測(cè)上述FAM107A表達(dá)水平的巧光定量PCR試劑盒。 優(yōu)選采用引物對(duì)為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。
[000引進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了上述巧光定量PCR試劑盒使用方法。
[0009] 本發(fā)明目的是提供了一種非小細(xì)胞型肺癌檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒檢測(cè) FAM107A蛋白。進(jìn)一步的，所述的試劑盒還包括其他檢測(cè)試劑。
[0010] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)試劑盒為檢測(cè)FAM107A蛋白的化ISA檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒中 的抗體可采用市售的FAM107A單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的試劑盒還包括；HRP標(biāo)記的IgG 抗體、辣根過(guò)氧化物酶、底物緩沖液、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照樣品BSA。
[0011] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)試劑盒為檢測(cè)FAM107A蛋白的膠體金檢測(cè)試劑盒，所述的抗體 可采用市售的FAM107A單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒采用膠體金免疫層 析技術(shù)或膠體金滲濾法。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)（T) 噴點(diǎn)有抗FAM107A單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)（C)噴點(diǎn)有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。
[0012] 本發(fā)明目的是提供FAM107A基因和/或FAM107A蛋白在制備非小細(xì)胞型肺癌的診 斷或者預(yù)后產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明對(duì)已發(fā)表的非小細(xì)胞型肺癌高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta 分析，獲得1063個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)水平上調(diào)的基因464個(gè)，表達(dá)水平下調(diào)的基因 599個(gè)，并利用KEGG、GO、OMIM等各種生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)和MATLAB等分析工具對(duì)差異表達(dá) 基因進(jìn)行功能分析，進(jìn)而篩選出影響肺腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因和重要的信號(hào)通路，另外 基于數(shù)據(jù)挖掘分析的結(jié)果，篩選出候選基因FAM107A。
[0014] 進(jìn)而，本發(fā)明通過(guò)巧光定量PCR方法W 5例非小細(xì)胞型肺癌患病病人的癌組織和 正常組織為樣本驗(yàn)證篩選到的非小細(xì)胞型肺癌致病基因FAM107A在非小細(xì)胞型肺癌患病 病人的癌組織和正常組織的表達(dá)情況。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先分別提取了 5例非 小細(xì)胞型肺癌患病病人的癌組織和5例正常組織，對(duì)其總RNA的進(jìn)行提取，設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增 FAM107A基因的2條引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2,用于擴(kuò)增內(nèi)參基因e-actin的2 條引物SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4。制備了含有FAM107A基因序列的標(biāo)準(zhǔn)DNA模板，并進(jìn) 行了敏感性實(shí)驗(yàn)。進(jìn)而，采用qRT-PCR的方法比較FAM107A基因在非小細(xì)胞型肺癌組織和 正常組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明；qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，其中FAM107A在正常組織中的 表達(dá)水平明顯高于非小細(xì)胞型肺癌癌組織，實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了生物信息學(xué)篩選結(jié)果。進(jìn)一步， 發(fā)明人在134例非小細(xì)胞型肺癌患病病人的癌組織及癌旁組織中檢測(cè)FAM107A基因表達(dá)情 況，結(jié)果顯示132例非小細(xì)胞型肺癌患病病人的癌組織中FAM107A基因表達(dá)低于癌旁組織 中的表達(dá)，準(zhǔn)確率達(dá)98. 5%，即FAM107A基因與非小細(xì)胞型肺癌具有很好的相關(guān)性，可用于 制備非小細(xì)胞型肺癌輔助診斷或者預(yù)后制劑。
[0015] 本發(fā)明目的是提供了一種檢測(cè)非小細(xì)胞型肺癌的巧光定量PCR試劑盒及其使用 方法。該P(yáng)CR試劑盒適合于目前存在市場(chǎng)上的所有類型巧光定量基因擴(kuò)增儀，靈敏度高，定 量快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。
[0016] 進(jìn)一步，上述巧光定量PCR試劑盒組分包括；特異性引物、內(nèi)參引物、巧光定量PCR 反應(yīng)液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ ID NO. 1， 下游引物序列為SEQ ID N0.2。所述內(nèi)參引物為e-actin內(nèi)參引物，上游引物序列為SEQ ID NO. 3,下游引物序列為SEQ ID NO. 4。所述巧光定量PCR反應(yīng)液包括2XUltralSYBR One Step RT-qPCR Buffer (With ROX)、Supe;rEnzyme Mix 和 RNase-Free Water。
[0017] 本發(fā)明還公開(kāi)了一種檢測(cè)非小細(xì)胞型肺癌的巧光定量PCR試劑盒的使用方法，巧 光定量PCR體系；上游引物；下游引物；樣品RNA 10pg-100ng;2XUltralSYBR One St巧 RT-qPCR Buffer (With ROX)，Supe;rEnzyme Mix,加 RNase-Free Water 至 25 uL。巧光定量 PCR 程序；95°C lOmin 預(yù)變性，接 30-40 個(gè)循環(huán)；95°C 15s，60°C 60s。
[001引所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑。
[0019] 所述的試劑盒應(yīng)用于非小細(xì)胞型肺癌FAM107A基因的定量檢測(cè)，一步法巧光定量 PCR，方便快速，適用于臨床檢測(cè)。
[0020] 本發(fā)明還檢測(cè)了本試劑盒靈敏性，結(jié)果顯示本試劑盒檢測(cè)范圍為106-10 2copies/ y 1，最小檢出濃度為lOOcopies/y 1。
[0021] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：
[0022] (a)本發(fā)明提供的FAM107A與非小細(xì)胞型肺癌具有很好的相關(guān)性，可用于制備非 小細(xì)胞型肺癌輔助診斷或者預(yù)后制劑。
[002引 化）本發(fā)明提供的檢測(cè)FAM107A表達(dá)水平的巧光定量PCR試劑盒包含了從RNA提 取到巧光定量實(shí)驗(yàn)所用的整套試劑，并且采用了一步法巧光定量PCR，既方便臨床使用，又 保證了結(jié)果的一致性。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1RNA提取后凝膠電泳圖
[0025] 圖2巧光定量擴(kuò)增曲線圖
[0026] 圖3巧光定量溶解曲線圖
[0027] 圖4FAM107A基因在癌組織及正常組織中相對(duì)表達(dá)量圖
【具體實(shí)施方式】
[002引下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可W理解；在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 W對(duì)該些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實(shí)施檢測(cè)。
[0029] 實(shí)施例1非小細(xì)胞型肺癌組織及正常組織FAM107A基因表達(dá)情況
[0030] 一材料和方法
[0031] 1、材料
[0032] 收集5例非小細(xì)胞型肺癌癌組織及5例正常組織，對(duì)其進(jìn)行分組及編號(hào)。
[0033] 2、方法
[0034] 2. 1非小細(xì)胞型肺癌組織及正常組織總RNA的提取
[0035] 按康為世紀(jì)超純RNA提取試劑盒扣Itrapure RNA Kit值化se I)，貨號(hào)CW0597)說(shuō) 明書(shū)提取非小細(xì)胞型肺癌組織及正常組織的RNA，結(jié)果見(jiàn)圖1所示，凝膠電泳顯示RNA的完 整性，用核酸蛋白儀測(cè)定RNA的濃度和純度。
[0036] 采用超純RNA提取試劑盒（貨號(hào)CW0597)提取，主要操作步驟如下；
[0037] 1.樣品處理，30-50mg組織在液氮中充分研磨后加入1ml Buffer化T，或在組織樣 品中加入1ml Buffer化T后勻漿處理。
[003引 2.樣品中加入Buffer化T后反復(fù)吹打幾次，使樣本充分裂解。室溫放置5分鐘， 使蛋白核酸復(fù)合物完全分離。
[0039] 3. W每1ml Buffer化T加入200 氯仿的比例加入氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩 15秒，室溫放置2分鐘。
[0040] 4. 4°C 12, 000巧m(~13, 400Xg)離屯、10分鐘，此時(shí)樣品分為S層；紅色有機(jī)相， 中間層和上層無(wú)色水相，RNA主要在上層水相中，將上層水相移到一個(gè)新的RNase-Free離 屯、管（自備）中。
[0041] 5.在得到的水相溶液中加入等體積的70%己醇（無(wú)RNase的水配制），顛倒混勻。
[0042] 6.將上步所得溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2ml)的吸附柱 (Spin Column RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12, 00化pm離屯、20秒，倒掉 收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[00創(chuàng) 7.向吸附柱中加入350 Buffer RW1，12, 000巧m離屯、20秒，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0044] 8.配制面ase I混合液：取52 y 1 RNase-Free Water,向其中加入 8 y 110 X Reaction Buffer 和 20 y 1 面ase I (1U/ y 1)，混勻，配制成終體積為 80 y 1 的反 應(yīng)液。
[0045] 9.向吸附柱中直接加入80 y 1面ase I混合液