可用于治療胰島素依賴性糖尿病的干細(xì)胞和胰腺細(xì)胞的制作方法
【專利說明】可用于治療胰島素依賴性糖尿病的干細(xì)胞和胰腺細(xì)胞
[0001] 相關(guān)專利申請的交叉援引
[0002] 本申請要求于2012年6月26日提交的美國臨時(shí)申請61/664, 259的優(yōu)先權(quán)，將其 整體引入本申請。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] A.對胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞未滿足的需求
[0005] 胰島素依賴性糖尿病是一種由胰腺胰島素產(chǎn)生細(xì)胞喪失為特征的疾病。所述胰島 素產(chǎn)生細(xì)胞，也稱為"0"細(xì)胞，通常存在于被稱為胰島（islets of Langerhans)的小球結(jié) 構(gòu)中，該結(jié)構(gòu)分散遍布于胰腺中。已證明在人和動(dòng)物中替代胰島（包括其功能性0細(xì)胞） 的移植可治愈胰島素依賴性糖尿病。在此過程中，自一個(gè)或多個(gè)已故器官供體的胰腺純化 胰島，并將胰島注射至機(jī)體多個(gè)部位中的一個(gè)。一些胰島在此過程中存活并駐留于機(jī)體中， 并且在機(jī)體中制造和分泌胰島素。這足以治愈該患者數(shù)年，直至移植胰島的壽命結(jié)束。參 見 Shapiro (2011)和 Robertson (2010)〇
[0006] 盡管該方法可有效地治療糖尿病，但沒有足夠的供體胰腺，僅能治療很小一部分 的糖尿病患者。因此，需要0細(xì)胞或胰島的替代性來源。
[0007] B.胰腺細(xì)胞的替代性來源
[0008] 一種已經(jīng)獲得許多關(guān)注的有前景的替代胰腺細(xì)胞的來源是多能干細(xì)胞。多能干細(xì) 胞收獲自胚胎，或者可人工生成，通過將完全分化的體細(xì)胞導(dǎo)向胚胎樣狀態(tài)，即通過將成體 細(xì)胞"重編程"為類似于自胚胎收獲的細(xì)胞的細(xì)胞。不論是通過收獲或者重編程，所有多能 干細(xì)胞共有以下三個(gè)特征：
[0009] ?表達(dá)干細(xì)胞基因：它們表達(dá)通常在早期哺乳動(dòng)物胚胎中表達(dá)的基因。
[0010] ?不死性：它們在培養(yǎng)中可擴(kuò)增至理論上無限的數(shù)量。
[0011] ?成熟為哺乳動(dòng)物機(jī)體的所有譜系：所有成體器官均源于早期胚胎三種組織譜 系中的一種。這三種組織譜系為：內(nèi)胚層，胰腺和其它腸道器官自其形成；中胚層，肌肉 和骨骼自其形成；和外胚層，腦和皮膚自其形成。參見Yamanaka(2012)，Plath(2011)，L ai， （2011)和 Stover(2011)。
[0012] 已經(jīng)設(shè)計(jì)出了多種方案操作多能干細(xì)胞以形成胰腺細(xì)胞。這些方案中的一些 能夠驅(qū)使多能干細(xì)胞分化形成與胎兒胰島祖細(xì)胞相似的細(xì)胞。參見Kroon(2008)和 Rezania(2011)。然而，這些方案均無法生成這樣的胰腺細(xì)胞：能夠進(jìn)一步成熟為功能性的、 產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞，可以按照上述方式用于治療。
[0013] 常規(guī)的獲得胰腺祖細(xì)胞的方案有許多不足和劣勢，其中主要的為：
[0014] ?胰腺祖細(xì)胞群不純，被非胰腺細(xì)胞污染。多能干細(xì)胞傾向于形成所有三種胚層。 因此，即使最高效的方案產(chǎn)生的胰腺細(xì)胞群也混有非胰腺細(xì)胞。
[0015] ?胰腺祖細(xì)胞群被未成熟細(xì)胞污染。這些細(xì)胞保留不死的性質(zhì)，并可能在移植至患 者后引發(fā)腫瘤。
[0016] ?胰腺祖細(xì)胞未能成熟為完全功能性的產(chǎn)生胰島素的0細(xì)胞。
[0017] ?培養(yǎng)細(xì)胞的方案采用了管理機(jī)構(gòu)通常不接受用于人類使用的試劑和操作。
[0018] 參見 Matveyenko(2010)，Tahamtani(2013)。也參見美國聯(lián)邦法規(guī)，第 21 編，第 1271部分。
[0019] C.成體胰腺的細(xì)胞異質(zhì)性
[0020] 胰島起源自胚胎發(fā)生期間從正在發(fā)育的胰腺管萌出的祖細(xì)胞。在健康個(gè)體的生命 過程中，0細(xì)胞僅僅通過現(xiàn)存0細(xì)胞的復(fù)制而生成。參見Dor(2004)。e細(xì)胞復(fù)制過程 的發(fā)生在體重增加、懷孕以及胰腺損傷后的恢復(fù)期間更為迅速。迄今為止，尚未做到在培養(yǎng) 中復(fù)制分離的0細(xì)胞而不喪失其成熟特性。參見Pagluca(2013)。
[0021] 尚未通過譜系追蹤實(shí)驗(yàn)在成熟組織中鑒定胰腺干細(xì)胞或祖細(xì)胞。然而，許多出版 物已經(jīng)描述了自哺乳動(dòng)物胰腺分離的細(xì)胞，其據(jù)說展示了一些干細(xì)胞特性。這些細(xì)胞已在 導(dǎo)管組織中、在外分泌組織中和在胰島本身中鑒定。例如，參見Gong(2012)，Noguchi (2010) 和Ciba(2009)。據(jù)描述，它們具有有限的復(fù)制能力并被誘導(dǎo)表達(dá)胰島素。
[0022] 此外，許多已公開的專利文獻(xiàn)描述所述成體干細(xì)胞直接收獲自成熟胰腺。參 見美國專利6436704、6815203、7544510、8110399和8377689,以及公開的美國專利申請 2004/0115805。
[0023] 這些細(xì)胞群尚未以治療患者所需的規(guī)模制備，而且均未顯示應(yīng)答于葡萄糖而適當(dāng) 地分泌胰島素。由于這些原因，這些細(xì)胞群尚未顯示臨床效益。
[0024] 例如，美國專利8377689提及胰腺細(xì)胞在培養(yǎng)中復(fù)制并被誘導(dǎo)表達(dá)胰島素。然而， 根據(jù)描述，這些細(xì)胞具有有限的復(fù)制能力而且并未成熟為完全功能性的0細(xì)胞或者至少 不能逆轉(zhuǎn)嚙齒類動(dòng)物模型中的糖尿病。即，實(shí)際獲得的結(jié)果顯示，在"糖尿病小鼠"模型中， "在5周內(nèi)自…高血糖癥（>400mg/dl)恢復(fù)至接近正常（<300mg/dl)，而未移植的糖尿病小 鼠在整個(gè)研宄期間為高血糖。"第45欄，18行后各行（重點(diǎn)添加）。然而，在糖尿病小鼠模 型中，"正常"是約150mg/dl，而根據(jù)報(bào)告，持續(xù)讀數(shù)高于250mg/dl被視為穩(wěn)定的糖尿病狀 態(tài)的證明。例如，參見Dang (2013)。
[0025] 因此，由于缺乏可放大的藥用級(jí)別治療性胰腺細(xì)胞的來源，通過移植替代0細(xì)胞 或胰島來治愈糖尿病的策略的潛力基本上尚未轉(zhuǎn)化為實(shí)際。
[0026] 所有這些工作都不同于本文所述的發(fā)明，因?yàn)槠渖婕皬牟溉閯?dòng)物胰腺分離干細(xì) 胞。本發(fā)明涉及從胰腺或其它來源分離完全成熟的非干細(xì)胞，其在培養(yǎng)物中被操作以獲得 干細(xì)胞特性。本方法依賴于對人類器官內(nèi)成熟細(xì)胞的遺傳多樣性的掌控，來鑒定可被操作 成為治療有用的干細(xì)胞的亞群。存在于成熟人類組織中的細(xì)胞多樣性是近來才認(rèn)識(shí)到的， 而對成熟胰腺內(nèi)的細(xì)胞異質(zhì)性的傳統(tǒng)理解尚不全面。
[0027] 發(fā)明概述
[0028] 如前所述，現(xiàn)有的產(chǎn)生胰腺細(xì)胞的技術(shù)不能生成有效的替代胰腺細(xì)胞（即，可被 移植至哺乳動(dòng)物機(jī)體部位，在該位置駐留并行使天然胰腺細(xì)胞的功能的細(xì)胞）。本發(fā)明通過 提供藥用級(jí)別的（即，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA)和/或其它此類管理機(jī)構(gòu)認(rèn)為可接 受用于人類使用的）替代胰腺細(xì)胞以及含該細(xì)胞的組合物克服了此點(diǎn)不足和其它缺點(diǎn)。例 如，參見美國聯(lián)邦法規(guī)，第21編，第1271部分，將其內(nèi)容整體引入本申請。
[0029] 關(guān)于一般意義上的人類細(xì)胞療法，世界范圍內(nèi)監(jiān)管機(jī)構(gòu)的可接受性標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)所采 用的細(xì)胞的安全性和有效性。在此語境中核心的安全性擔(dān)憂是：（i)細(xì)胞形成腫瘤的趨勢 和（ii)從該細(xì)胞可能接觸過的動(dòng)物源試劑轉(zhuǎn)移毒性、免疫原性或感染性顆粒的風(fēng)險(xiǎn)。有效 性標(biāo)準(zhǔn)包括：細(xì)胞群對于給定的細(xì)胞功能是強(qiáng)效的，并且在該有效治療期間是穩(wěn)定的。
[0030] 因此，本發(fā)明的含有替代胰腺細(xì)胞的組合物（1)不含降低效力或行使不需要功能 的非治療性細(xì)胞，但其組成的治療性細(xì)胞（2)是根據(jù)國際上接受的標(biāo)準(zhǔn)使用明確限定的 (defined)、非動(dòng)物來源的組分培養(yǎng)的，且（3)不是遺傳修飾的、轉(zhuǎn)化的、核型異常的，或者 具有其他高風(fēng)險(xiǎn)的不穩(wěn)定性或致瘤性特征的。
[0031] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種包含替代胰腺細(xì)胞的非多能祖細(xì)胞的 組合物。所述祖細(xì)胞（i)不具有整合至其基因組的重編程基因，（ii)依照僅采用明確限定 的（defined)試劑的方案分化為胰腺譜系，且（iii)實(shí)質(zhì)上不能分化為中胚層譜系。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用于生成包含此類替代胰腺細(xì)胞的非多能 祖細(xì)胞的組合物的方法，所述替代胰腺細(xì)胞適用于治療胰島素依賴性糖尿病。本發(fā)明的方 法包括：
[0033] a.在最低限度的（minimal)、明確限定的（defined)培養(yǎng)條件中自有活力的人胰 腺組織收獲人細(xì)胞；
[0034] b.培養(yǎng)所述原代人細(xì)胞數(shù)天時(shí)間，天數(shù)少于約9天；然后
[0035] c.使用重編程基因重編程來自（b)的原代人細(xì)胞，從而獲得不具有基因組整合的 重編程基因、但具有干細(xì)胞形態(tài)學(xué)的重編程細(xì)胞；
[0036] d.首先在最低限度的、明確限定的培養(yǎng)條件中，對在（c)中獲得的重編程細(xì)胞選 擇在不喪失干細(xì)胞形態(tài)的情況下增殖的能力，從而獲得增殖的重編程細(xì)胞；然后
[0037] e.其次，從所述增殖的重編程細(xì)胞中選擇有下述特征的細(xì)胞群：（i)在僅采用明 確限定試劑的方案的過程中，有能力存活并分化為胰腺譜系，和（ii)實(shí)質(zhì)上不能分化為中 胚層譜系，
[0038] 從而獲得前述的非多能祖細(xì)胞。
[0039] 本發(fā)明的另一方面涉及包含替代胰腺細(xì)胞的組合物，其適用于治療胰島素依賴性 糖尿病，其中（A)所述替代胰腺細(xì)胞衍生自上述非多能祖細(xì)胞和（B)多于約90%的組成該 組合物的細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物Pdxl、Nkx6. 1和NeuroDl。本發(fā)明