多肽、其生產(chǎn)方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體特別涉及一種祀向人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)的多肽、其生產(chǎn)方法以及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是一種嚴(yán)重危害人類身體健康的重大疾病。世界衛(wèi)生組織所屬的“國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)”(IARC)預(yù)計(jì)，2030年癌癥病例將達(dá)2140萬(wàn)例，死亡將超過(guò)1320萬(wàn)人。癌癥的治療與控制已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一個(gè)亟待解決的難題。癌癥治療的常用手段主要有手術(shù)切除、放療和化療，但這些常規(guī)療法常會(huì)帶來(lái)多種副作用，如手術(shù)切除難以對(duì)浸潤(rùn)性腫瘤做到完全切除且易復(fù)發(fā)；放化療對(duì)患者的健康組織會(huì)造成損傷，也容易產(chǎn)生抗藥性。
[0003]鑒于常規(guī)治療手段的缺陷與副作用，在抗癌藥物研發(fā)領(lǐng)域，研究者們一直在致力于靶向治療藥物的研制。根據(jù)腫瘤發(fā)病機(jī)制以及涉及到的信號(hào)通路研制出的靶向治療藥物能精確且特異地靶向病灶，從而能夠有效治療腫瘤且大大降低對(duì)正常組織的副作用。
[0004]常見(jiàn)的抗腫瘤靶向治療藥物多是某影響腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞信號(hào)通路組分蛋白的單克隆抗體。目前已有多種靶向治療藥物進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，也有藥物通過(guò)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)。如VEGF的單克隆抗體巴伐單抗,商品名Avastin,能抑制腫瘤新生血管的形成達(dá)到抑制腫瘤的生長(zhǎng)的目的；HER2受體的單克隆抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab),商品名Herceptin,能靶向治療HER2過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。目前，單抗藥物的研發(fā)已成為了靶向治療藥物的研制的一個(gè)重要的方向，但抗體藥物研制的費(fèi)用極高，生產(chǎn)成本也高，因此，目前常用的單抗藥物價(jià)格也是極為昂貴的。另外，抗體的分子量大，對(duì)于結(jié)構(gòu)緊密的實(shí)體瘤難以滲透到內(nèi)部，這會(huì)影響其療效的發(fā)揮。因此，尋找新的靶向藥物分子是靶向藥物研發(fā)的一個(gè)重要的方向。
[0005]多肽篩選成本較低，篩選周期也較短，改造方便，因此在靶向藥物研制中備受關(guān)注。多肽分子量小，有較低的抗原性；且易于滲透進(jìn)入細(xì)胞間隙，便于發(fā)揮作用；另外能通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)的靶向多肽組合形成多靶向藥物，應(yīng)用前景良好。
[0006]惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位，經(jīng)淋巴道，惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位，經(jīng)淋巴道，血管或體腔等途徑，到達(dá)其他部位繼續(xù)生長(zhǎng)，稱腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移給腫瘤的治療帶來(lái)極大的困難，因此，如何抑制或減緩腫瘤的轉(zhuǎn)移是腫瘤靶向治療研究的一個(gè)重要的課題。人的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)所激活的受體c_Met介導(dǎo)的信號(hào)通路是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要途徑之一，已經(jīng)有多項(xiàng)研究證明C-Met通路的調(diào)節(jié)紊亂與受體或者配體的高表達(dá)有關(guān)，目前，已經(jīng)有研究者篩選到了 C-Met的單克隆抗體或者多肽，而HGF的抗體也已經(jīng)獲得。
[0007]鑒于靶向多肽在作為靶向藥物中的優(yōu)勢(shì)，篩選一種能夠靶向HGF的多肽具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的之一在于提供一種多肽，其具有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，能特異性靶向結(jié)合與腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)的信號(hào)通路組分一肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，從而可以抑制HGF/c-Met信號(hào)通路相關(guān)的細(xì)胞遷移過(guò)程，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該多肽有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用，在抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物研發(fā)與制備中有廣泛的應(yīng)用前景。
[0009]本發(fā)明的目的之二在于提供用以編碼前述多肽的、分離的多核苷酸。
[0010]本發(fā)明的目的之三在于提供包含用以編碼前述多肽的多核苷酸的表達(dá)載體。
[0011]本發(fā)明的目的之三在于提供包含前述多核苷酸或前述載體的宿主細(xì)胞。
[0012]本發(fā)明的目的之四在于提供前述多肽在制備腫瘤細(xì)胞檢測(cè)或診斷試劑盒的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的目的之五在于提供前述多肽在制備肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子靶向制劑的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的目的之五在于提供一種腫瘤細(xì)胞檢測(cè)或診斷試劑盒，其包含前述的多肽。
[0015]本發(fā)明的目的之六在于提供前述多肽在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明的目的之七在于提供一種抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物組合物，其包含可藥用載體及前述的多肽。
[0017]關(guān)于本發(fā)明的具體內(nèi)容，將在下文結(jié)合附圖及相應(yīng)實(shí)施例做詳細(xì)解釋說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0018]通過(guò)結(jié)合附圖進(jìn)行的示例性實(shí)施例的以下描述，本發(fā)明的這些和/或其他方面和優(yōu)點(diǎn)將變得清楚和更易于理解，其中:
圖1示出了前7輪篩選的PE熒光強(qiáng)度隨著富集的次數(shù)增加不斷加強(qiáng)的流式細(xì)胞儀記錄的等高線圖(PE指代藻紅蛋白受激發(fā)所發(fā)出的熒光，SSC指代流式細(xì)胞儀檢測(cè)的顆粒的側(cè)向散射光數(shù)據(jù)；eCPX為篩選中使用的細(xì)菌展示多肽庫(kù)原庫(kù)的自命名，Ml代表完成了一次磁珠分選，縮小了庫(kù)容的細(xì)菌展示多肽庫(kù)子庫(kù)，而F1-F6分別指代進(jìn)行了 I至6次熒光激活細(xì)胞分選術(shù)分選得到的庫(kù)容更小的子庫(kù))。
[0019]圖2示出了在經(jīng)過(guò)較為嚴(yán)格的洗滌條件下，單克隆菌clone I以及clone 2所帶PE熒光的強(qiáng)度變化，間接地示出了兩個(gè)細(xì)菌單克隆與HGF結(jié)合的比例變化情況。
[0020]圖3示出了在孵育過(guò)程中使用不同的細(xì)胞因子干擾單克隆菌clone I和clone 2分別與HGF孵育后在流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)合率匯總直方圖(BSA指代牛血清白蛋白，VEGF指代血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，bFGF指代堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，EGF指代表皮生長(zhǎng)因子；另，圖中*表示該數(shù)據(jù)與HGF組比較有顯著性差異，0.01〈P〈0.05)。
[0021]圖4示出了使用MTT法檢測(cè)不同濃度的control p印tide，HGP-1和HGP-2多肽在獨(dú)立使用時(shí)對(duì)人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖的抑制作用(**表示該組數(shù)據(jù)與HGF組比較有極顯著差異，P〈0.01)。
[0022]圖5示出了使用細(xì)胞劃痕法檢測(cè)不同濃度的control p印tide，HGP-1和HGP-2多肽在獨(dú)立使用時(shí)對(duì)人類黑色素瘤細(xì)胞系MDA-MB-435S遷移的抑制作用(**表示該組數(shù)據(jù)與HGF組比較有極顯著差異，P〈0.01)。
具體實(shí)施方案
[0023]根據(jù)本發(fā)明的具有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所具有的氨基酸序列的多肽是通過(guò)細(xì)菌表面展示多肽庫(kù)和磁珠分選以及熒光激活細(xì)胞分選術(shù)篩選得到，得到的多肽可以與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)特異性地結(jié)合，因此可望能夠運(yùn)用于靶向治療腫瘤遷移的靶向藥物研發(fā)中。
[0024]下面示例性實(shí)施例中未注明條件的實(shí)驗(yàn)方法可以按本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，例如，可以參照 Sambrook 等人的《Molecular cloning: a laboratory manual))(NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。
[0025]1.構(gòu)建細(xì)菌表面展示隨機(jī)肽庫(kù)
本發(fā)明所使用的細(xì)菌表面展示隨機(jī)肽庫(kù)是從美國(guó)加州大學(xué)圣巴巴拉分?；瘜W(xué)工程系的Patrick S.Daugherty實(shí)驗(yàn)室獲得。本實(shí)施例中選擇大腸桿菌MC1061 [F_araD139D (ara-leu) 7696 galE15 galK16 D (lac) X74 rpsL (StrR) hsdR2 (rK-mK]3) mcrA mcrBl](Casadaban and Cohen, 1980)菌株進(jìn)行細(xì)菌展不多肽庫(kù)的構(gòu)建,所用質(zhì)粒為pBAD33。該細(xì)菌展示多肽庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程如下。首先，對(duì)外膜蛋白(OmpX, outer membrane protein X)進(jìn)行改造，用氨基酸序列GSKSRR把OmpX的C端和N端連上，并在OmpX第2個(gè)環(huán)(loop)的s53和s54殘基之間打開(kāi),形成游離于胞外的C00H端和NH2端,成為CPX (circularlypermuted outer membrane protein OmpX)骨架(請(qǐng)參見(jiàn) Rice et al.(2006) proteinSc1.15,825-836)。而把CPX骨架蛋白的165位的丙氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?66位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸，成為 eCPX (enhance CPX)。(請(qǐng)參見(jiàn) Jeffrey J.Rice et al.ProteinEngineering, Design & Select1n.2008, 21(7): 435 - 442.)將包含有 15個(gè)隨機(jī)氨基酸的序列X15連接到CPX骨架的N端。把經(jīng)過(guò)改造的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌MC1061 [F_araD139D (