切位點（參見加粗斜體堿 基）。
[0058] 擴增Dni_2所用引物如下：
[0059] 5 ' 端引物：5 '-GGGGCGGCCGCGCAATGACAACAGGTGGA-3，
[0060] 3' 端引物：5'-TTTCG(;(;CGCTGGCGTTTGGA-3,
[0061] 5'端引物引入NotI酶切位點，3'端引物引入XhoI酶切位點（參見加粗斜體堿 基）。
[0062] PCR反應體系為：
[0063] 10XLAPCRBuffer5yL;dNTP(2. 5mmol/L)6yL;5' 端引物 2yL;3' 端引物 2yL;cDNA1yL;LATaq0? 5yL;去離子水 33. 5yL。
[0064] PCR反應條件為：
[0065] 94°C預變性 5min;94°Clmin，55°Clmin，72°C2min，30 個循環(huán)；72°C延伸lOmin。 反應結束后，PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，結果如圖1所示。
[0066] 用PCR產物純化試劑盒回收目的片段，利用T-A克隆方法直接將PCR產物連接于 PMD18-T載體上，連接產物轉化E.coliDH5a感受態(tài)細胞，藍白斑篩選，挑取陽性克隆，分 別進行酶切鑒定和DNA序列測定，目的基因堿基序列如SEQIDNO. 1所示。
[0067] 片段l(Din_l)陽性質粒和pET28a載體分別經NcoI、NotI雙酶切后，回收目的 片段及線性化載體片斷，用T4DNA連接酶連接，構建重組表達質粒pET28a-Dm，轉化DH5a 感受態(tài)細胞，提取重組質粒進行雙酶切鑒定和序列鑒定。再將片段2 (Dm-2)陽性質粒和 pET28a-Dm質粒分別經NotI和XhoI雙酶切后，回收目的片段及線性化載體片斷，用T4 DNA連接酶連接，構建重組表達質粒pET28a-2Dm，轉化DH5a感受態(tài)細胞，提取重組質粒進 行雙酶切鑒定和序列鑒定。
[0068] 經鑒定正確的重組質粒轉入宿主菌BL21 (DE3)，挑取單克隆接種到含有50yg/ml 卡那霉素LB培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)過夜，按1 : 100的比例將培養(yǎng)物接種于LB培養(yǎng)基中， 250rpm震蕩培養(yǎng)2小時左右，使0D6QQ= 0. 6,按1 : 100的比例加入lOOmMIPTG誘導培養(yǎng) 3小時，離心收集菌體。將菌體加入適量的IX上樣緩沖液，采用12%的SDS-PAGE鑒定，產 物r2Dni蛋白表達量可占菌體總蛋白30-40% (見圖2)。
[0069] 以逆轉錄獲得的cDNA為模板進行PCR擴增時，利用上述引物擴增出兩段基因片 段，即Dni-1和Dni-2,該兩段基因片段的堿基序列是完全一致的，通過連接酶連接到同一重 組質粒中，轉入宿主細胞后，經大腸桿菌菌株表達獲得r2Dm蛋白。
[0070] 經大腸桿菌菌株BL21 (DE3)表達的r2Dm蛋白以包涵體的形式存在，菌體經超聲波 破碎后，離心可以得到r2Dm蛋白包涵體，沉淀進一步用Ni-NTA蛋白純化系統(tǒng)（QIAGEN公 司）可以較快的得到r2Dm蛋白純品，經測序，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示，該氨基 酸序列是由包含兩段相同序列的基因片段，即Dm-1和Dni-2編碼獲得。
[0071] 實施例2抗原蛋白特異性試驗
[0072] 取實施例1中純化的r2Dni蛋白樣品，經10%膠濃度SDS-PAGE電泳后，轉印至硝 酸纖維素膜上，5%脫脂乳4°C封閉過夜，TOST漂洗3次，浸入1 : 500稀釋的鴨TMUV高免 鴨血清中，37°C作用lh，PBST洗三次，再將膜浸入1 : 100稀釋的HRP標記的羊抗鴨酶標二 抗，37°C作用lh，PBST洗三次，最后用DAB顯色，膜上可見一 35kDa棕色條帶（見圖3)。
[0073] 實施例3ELISA試劑盒的制備
[0074] 1、制備抗體檢測板
[0075] 用pH9. 6的0? 05M碳酸鹽緩沖液作包被液，將純化的r2Dni蛋白稀釋為5yg/ml， 按100y1/孔加入96孔酶標板，4°C包被過夜，用含5%脫脂乳的PH7. 4的0. 01M磷酸鹽緩 沖液（PBS)37°C封閉2小時，再以含0. 05%吐溫-20的0. 01M磷酸鹽緩沖液（PBST)洗滌3 次甩干，真空干燥后，裝入含干燥劑的包裝袋中置4°C保存。
[0076] 2、制備100X濃縮酶標二抗貯存液
[0077] 將KPL公司HRP標記的羊抗鴨酶標二抗利用方陣試驗確定最佳工作濃度，再以含 0. 2 %BSA，0. 1 %吐溫-20,0. 02 %硫柳汞鈉，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液稀釋至200倍工作濃度， 加等量甘油混勻，_20°C保存，用于鴨TMUV抗體檢測試劑盒100X濃縮酶標二抗貯存液。
[0078] 3、配制樣品稀釋液、洗滌液、終止液
[0079] 樣品稀釋液：KH2P040. 2g，Na2HP04 ? 12H20 2. 9g，NaCl8g，成年牛血清 100ml，加蒸 餾水定容至l〇〇〇ml，再加0. 5ml吐溫-20,0. 01 %硫柳汞鈉；
[0080] 洗滌液：10\濃縮洗滌液為含0.5%吐溫-20的0.說磷酸鹽緩沖液（1(狀0 428， Na2HP04 ? 12H20 29g，NaCl80g，定容至 1000ml，pH7. 4,再加 5ml吐溫-20);
[0081] 終止液：2M硫酸溶液，即量取111. 2ml濃硫酸稀釋定容至1000ml。
[0082]4、制備陽性對照和陰性對照
[0083] 將經鴨TMUV滅活疫苗免疫健康紹興麻鴨獲得的高免陽性血清，用含0. 1%BSA、 0. 01%硫柳汞鈉和0. 05%吐溫-20的0. 01M磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)稀釋100倍后分裝即 為陽性對照（檢測0045_彡0.8);同樣將健康非免鴨血清用含0.1%854、0.01%硫柳汞鈉 和0. 05%吐溫-20的0. 01M磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)稀釋100倍后分裝即為陰性對照（檢測 〇K0? 2)。
[0084] 5、配置100X濃縮底物貯存液和底物緩沖液
[0085] 稱取lg四甲基聯苯胺（TMB)，用100mlDMS0溶解后避光保存，即得到100X濃縮 底物貯存液。
[0086] 0. 2M似2?04液257ml，0. 1M梓檬酸液243ml，0. 5g過氧化氫尿素，加蒸餾水定容至 1000ml，即得到底物緩沖液。
[0087] 6、ELISA試劑盒的使用方法
[0088] 1)將10X濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍即為洗滌液；
[0089] 2)將待檢血清用樣品稀釋液作1 : 100稀釋，按100y1/孔加入抗體檢測板中，同 時設空白（只加100y1樣品稀釋液）、陰性對照和陽性對照每孔各100y1，37°C孵育45分 鐘，甩干；
[0090] 3)每孔加洗滌液200y1，洗滌3次，每次間隔1分鐘，拍干；
[0091] 4)用洗滌液將100X濃縮酶標二抗貯存液稀釋100倍至工作濃度，每孔加 100y1，37°C孵育45分鐘，甩干；
[0092]5)每孔加洗滌液200y1，洗滌3次，每次間隔1分鐘，拍干；
[0093] 6)用底物緩沖液將100X濃縮底物貯存液稀釋100倍至工作濃度，每孔加 100yl，37°C避光孵育10分鐘；
[0094] 7)加50y1終止液，用酶標儀在450nm波長下讀取每孔光吸收值（0D45Clnm值）。
[0095] 7、結果判定標準
[0096] 以待檢樣本0D45(I值與標準陰性0D45(I值比值（P/N)作為判定標準。在陽性對照孔 〇D45(l大于0. 8,陰性對照孔0D45(|小于0. 2的前提下，樣品孔0D45(/陰性對照孔0D45(I> 2. 1 判定為陽性，反之為陰性。如果陽性對照孔〇D45(/j、于0. 8,或陰性對照孔0D45(|大于0. 2,表 明試劑盒失效或檢測操作有誤，需重新檢測。
[0097] 實施例4鴨DTMUV抗體的檢測
[0098] 采用實施例3制備的ELISA試劑盒以及建立的間接ELISA方法與中和試驗（NT) 進行比較。
[0099] 對108份來自浙江不同地區(qū)、不同年份的鴨血清樣品進行檢測，檢測結果（見表1) 顯示兩種方法的陽性符合率為83. 6% (51/61)，陰性符合率為79. 6% (39/49)，總符合率為 83. 3% (90/108)。
[0100] 表1血清樣品的間接ELISA與NT法檢測結果比較
[0101]
【主權項】
1. 一種抗原蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. -種編碼如權利要求1所述的抗原蛋白的基因。
3. -種含有如權利要求2所述基因的表達盒、重組載體或轉化子。
4. 如權利要求1所述的抗原蛋白在制備檢測鴨出血性卵巢炎病毒抗體試劑盒中的應 用。
5. 如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的鴨出血性卵巢炎病毒為鴨出血性卵 巢炎病毒YY5株。
6. -種含如權利要求1所述的抗原蛋白的檢測鴨出血性卵巢炎病毒抗體的試劑盒。
7. 如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒為ELISA試劑盒。
8. 如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括：抗體檢測板、樣品 稀釋液、陽性對照、陰性對照、酶標二抗貯存液、底物貯存液、底物緩沖液、洗滌液以及終止 液； 其中，所述的抗原檢測板為包被了所述抗原蛋白的酶標板，所述抗原蛋白的包被量為 0· 5 ~1 μ g/ 孔。
9. 如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗 鴨IgG(H+L)結合物。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測鴨出血性卵巢炎病毒抗體的抗原蛋白及其應用。該抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明還提供了所述的抗原蛋白在制備檢測鴨出血性卵巢炎病毒抗體試劑盒中的應用。本發(fā)明抗原蛋白靈敏度高，特異性好，在表達過程中抗原蛋白以包涵體形式在誘導宿主菌中存在，易于分離純化，可以進行工業(yè)化生產。應用本發(fā)明抗原蛋白制備ELISA檢測試劑盒，靈敏度高、特異性好，可用于鴨出血性卵巢炎病毒血清抗體的快速檢測。
【IPC分類】G01N33-68, C12N15-40, C07K14-18
【公開號】CN104650196
【申請?zhí)枴緾N201510083969
【發(fā)明人】余斌, 張存, 云濤, 陳柳, 倪征, 華炯鋼, 葉偉成
【申請人】浙江省農業(yè)科學院
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年2月16日