的液體發(fā)酵液與多種基質(zhì)按一定比例混合均勻，進(jìn)一步 通過噴霧干燥制得固體粉劑。
[0026] 本發(fā)明的微生物制劑的制備方法步驟二中所述的大量發(fā)酵培養(yǎng)基包含牛肉膏5. 0 區(qū)/1，蛋白胨10.0§/1，似(：15.0§/1，葡萄糖20.0 8/14117.0~7.2;本發(fā)明所述的微生 物制劑的制備方法步驟四中所述的基質(zhì)為微粉碳酸鈣、3 -環(huán)糊精；其中發(fā)酵液：微粉碳酸 鈣：3 -環(huán)糊精=10: (〇? 2-0. 8) : (0? 7-1. 3)。
[0027] 本發(fā)明所述的微生物制劑應(yīng)用于西蘭花真菌病害的防治，能夠有效抑制西蘭花灰 霉病、霜霉病、黑腐病、黑斑病、菌核病等病原真菌的生長，其防治效率達(dá)70%以上。
[0028] 以下結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)地闡述。以下實(shí)施例僅僅用于 說明和解釋本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的限制。
[0029] 實(shí)施例1短短芽孢桿菌BBC-3的分離、篩選以及保藏 (1)取土樣：選擇長勢(shì)良好的西蘭花田，在健康西蘭花植株的根際，伊去表土層2-3 cm, 取與西蘭花根際臨近的土壤10 g ;裝入已滅過菌的牛皮紙袋內(nèi)，封好袋口，并記錄取樣地 點(diǎn)、環(huán)境及日期。
[0030] (2)菌株分離和純化：在PB培養(yǎng)基上用平板稀釋法對(duì)土壤樣品進(jìn)行分離。具體操 作如下：準(zhǔn)確稱取10 g 土壤樣品，加入到盛有90 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，200 rpm 振蕩30 min，使土樣分布均勻成為土壤懸液，濃度為KT1;依此類推逐步10倍梯度稀釋至 KT2、10' 1〇-4... 1〇-7;選 10'1〇-6、1〇-7三個(gè)濃度在 80。。恒溫水浴 20 min，然后各取 100 ML 稀釋液涂布平板，放置于30 °C恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h;挑取不同形態(tài)的單菌落，用芽孢 染色進(jìn)行鑒定，各菌株用劃線法純化2-3次后轉(zhuǎn)接至PB培養(yǎng)基試管斜面，30 °C培養(yǎng)48 h， 4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0031] (3)活性菌株篩選： 初篩：以西蘭花病原真菌為指示菌，采用傳統(tǒng)五點(diǎn)對(duì)峙法測(cè)定不同菌株對(duì)西蘭花病原 真菌生長的抑制作用。具體操作方法如下：在PDA平板中心接種直徑5 mm的病原真菌菌 餅，四周等距離接種待篩選菌株，25 °C恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。以只接種西蘭花病原 真菌菌塊為對(duì)照。根據(jù)各篩選菌菌落邊緣與病原菌菌落邊緣之間的抑菌帶寬度確定拮抗程 度，保留效果優(yōu)良的菌株。
[0032] 復(fù)篩：將拮抗菌接種于PB液體培養(yǎng)基（50 mL/250 mL)，在200 rpm，30 °C條件下 培養(yǎng)48 h;將發(fā)酵液離心（8000 rpm，20 min)，棄沉淀，收集上清；將上清液用0.22 iim濾 膜過濾除去菌體，制成無菌發(fā)酵濾液。在制備好的病原真菌平板上用滅菌打孔器打孔，平板 打孔后向孔內(nèi)注入100 ML拮抗菌無菌濾液，病原真菌篩選板25 °C培養(yǎng)3~5 d，采用十字 交叉法測(cè)量抑菌圈直徑并計(jì)算平均抑制率。篩選出可產(chǎn)代謝活性產(chǎn)物對(duì)西蘭花病原真菌拮 抗作用最強(qiáng)的菌株，命名為BBC-3,對(duì)將該菌株進(jìn)行了 -80°C冷凍保藏。
[0033] 實(shí)施例2短短芽孢桿菌BBC-3抑菌譜的測(cè)定 選取具有代表性的西蘭花灰霉病、黑斑病、菌核病、黑腐病、辣椒疫霉菌、黃瓜炭疽病 菌、棉花枯萎病菌、灰霉病菌、葡萄灰霉病菌、立枯絲核菌、小麥赤霉病菌、玉米小斑病菌、番 茄早疫病菌、葉霉病菌、霜霉病菌等15種植物病原真菌為靶標(biāo)，采用平板擴(kuò)散法測(cè)定菌株 BBC-3的抑菌譜。菌株BBC-3對(duì)16種植物病原真菌均有較強(qiáng)的拮抗作用，其中對(duì)西蘭花灰 霉病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑可達(dá)30. 23 mm，其次為黑腐病菌，抑菌圈達(dá)28. 79 mm。
[0034] 表1短短芽孢桿菌BBC-3對(duì)不同植物病原真菌的抑制作用
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種短短芽孢桿菌BBC-3,該短短芽孢桿菌于2014年8月28日在中國微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為：CGMCC No. 9622。
2. 權(quán)利要求1所述的一種短短芽孢桿菌BBC-3在植物真菌病害防治中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種短短芽孢桿菌BBC-3在植物真菌病害防治中的應(yīng)用， 其特征在于所述的真菌病害包括灰霉病菌、霜霉病菌、黑腐病菌、菌核病菌、黑斑病菌、疫霉 菌、炭疽病菌、枯萎病菌、灰霉病菌或立枯絲核菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種短短芽孢桿菌BBC-3在植物真菌病害防治中的應(yīng)用，其 特征在于所述的植物為西蘭花。
5. -種含有如權(quán)利要求1所述的短短芽孢桿菌BBC-3的菌劑的制備方法，其特征在于 所述短短芽孢桿菌BBC-3用液體PB培養(yǎng)基，28°C振蕩培養(yǎng)得到發(fā)酵液，所述短短芽孢桿菌 BBC-3的菌含量彡2. OX IO9 cfu/mL，采用噴霧干燥法制得固體粉劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的含有短短芽孢桿菌BBC-3的菌劑的制備方法，其特征在于所 述噴霧干燥的基質(zhì)為微粉碳酸鈣、β-環(huán)糊精。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的含有短短芽孢桿菌BBC-3的菌劑的制備方法，其特征在于所 述發(fā)酵液為10重量份，所述微粉碳酸鈣為〇. 2~0. 8重量份，所述的β -環(huán)糊精為0. 7~1. 3 重量份。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6-7任意一項(xiàng)所述的含有短短芽孢桿菌BBC-3的菌劑的制備方法，其 特征在于所述固體粉劑含所述短短芽孢桿菌BBC-3總數(shù)> 2. 5Χ 101° cfu/g。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于防治西蘭花真菌病害的拮抗菌及其微生物制劑制備與應(yīng)用，屬于農(nóng)作物病害生物防治領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一株保藏號(hào)為CGMCC No.9622的短短芽孢桿菌BBC-3(Brevibacillus brevis)，以及含有此短短芽孢桿菌的微生物制劑的制備，還提供了所述短短芽孢桿菌BBC-3或微生物制劑在防治西蘭花真菌病害中的應(yīng)用。本發(fā)明所公開的保藏號(hào)為CGMCC No.9622的短短芽孢桿菌BBC-3經(jīng)平板對(duì)峙試驗(yàn)初篩及液體發(fā)酵液復(fù)篩所得，能有效防治西蘭花灰霉病、霜霉病、菌核病、黑腐病及黑斑病等多種真菌病害，防治效率達(dá)70%以上，且環(huán)境安全性好，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。CGMCC No.962220140828
【IPC分類】A01N63-00, A01P3-00, C12R1-01, C12N1-20
【公開號(hào)】CN104651260
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410467741
【發(fā)明人】張麗萍, 程輝彩, 習(xí)彥花, 尹淑麗, 張根偉, 仇艷肖, 崔冠慧, 張飛燕, 段普凡, 李書生
【申請(qǐng)人】河北省科學(xué)院生物研究所
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2014年9月15日