一種重組狂犬病病毒的構(gòu)建及培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉屬于重組疫苗領(lǐng)域。尤其涉及一種表達(dá)3G基因重組狂犬病病毒的構(gòu)建。
【背景技術(shù)】
[0002] 狂犬病是一種很重要的人畜共患病，每年約造成60000人死亡。在很多輔助中構(gòu) 建，狗仍是造成人感染狂犬病的主要原因，而在發(fā)達(dá)國家，狂犬病病毒主要存在于野生動物 宿主。實(shí)踐證明，對動物如狗進(jìn)行免疫能顯著降低人狂犬病的發(fā)病率，因此對動物實(shí)施免疫 對控制狂犬病及為重要。
[0003] 狂犬病病毒屬于彈狀病毒科狂犬病毒屬，基因組是不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，全長 約12Kb，編碼5種病毒蛋白：核蛋白N、磷蛋白P、基質(zhì)蛋白M、糖蛋白G和RNA聚合酶L。位 于囊膜上的糖蛋白G是主要的致病因子，同時也是誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的主要抗原。
[0004] 目前，狂犬病病毒SAD Bern (Sanafox)株在歐洲一直作為野生動物狂犬病免疫的 活疫苗，其具有較高的保護(hù)性和安全性。鑒于弱毒活疫苗在使用過程中存在較大的安全隱 患，我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定狂犬病的預(yù)防必須使用滅活疫苗。
[0005] 為獲得高效的、免疫原性更佳的狂犬病毒毒株，本研宄利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建 了一個含有3個同源G基因的狂犬病病毒。我們鑒定了該重組病毒株的生物學(xué)特性，并 將其與親本毒株SAD Bern (Sanafox)進(jìn)行了比較。結(jié)果表明重組病毒RV-r3G與rSAD Bern (Sanafox)相比具有更好的安全性和免疫原性，適用于狂犬病毒滅活疫苗的開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種狂犬病毒毒株的 構(gòu)建及培養(yǎng)方法，該毒株的免疫原性更佳。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種重組狂犬病病毒株，它是在對狂犬 病病毒SAD Bern全基因組序列進(jìn)行反向遺傳操作而獲得的狂犬病病毒基因組中插入2個 狂犬病病毒G基因，得到具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，即RV-r3G狂犬病病毒。
[0008] 其中，所述的對狂犬病病毒SAD Bern全基因組序列進(jìn)行反向遺傳操作而獲得狂犬 病病毒基因組包括：根據(jù)狂犬病病毒SAD Bern全基因組序列，得到8個互補(bǔ)DNA片段F1~ F8 ;將所述的8個互補(bǔ)DNA片段F1~F8進(jìn)行人工合成，得到所述的狂犬病病毒基因組。
[0009] 優(yōu)選地，所述狂犬病病毒基因組F1段的5'端引入Pmel酶切位點(diǎn)和錘頭狀核酶 (HamRz)、在F8的3'端引入Notl酶切位點(diǎn)和丁肝病毒核酶。
[0010] 其中，所述2個狂犬病病毒G蛋白根據(jù)狂犬病病毒SAD Bern全基因組序列獲得， 具體包括：根據(jù)狂犬病病毒SAD Bern全基因組序列，得到G基因；通過對G基因進(jìn)行擴(kuò)增， 得到所述的2個狂犬病病毒G基因；通過PCR重疊技術(shù)，將所述的2個狂犬病病毒G基因串 聯(lián)在一起，得到2G基因。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明另一方面提供一種重組狂犬病病毒株的構(gòu)建及培養(yǎng) 方法，包括以下步驟：
[0012] 對狂犬病病毒SAD Bern全基因組序列進(jìn)行反向遺傳操作，獲得狂犬病病毒基因 組；
[0013] 根據(jù)SAD Bern全基因組序列，得到2個G基因；
[0014] 將所得到的2個G基因插入到所述狂犬病病毒基因組中，得到具有SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列的重組狂犬病病毒。
[0015] 其中，所述的對狂犬病病毒SAD Bern全基因組序列進(jìn)行反向遺傳操作，獲得狂犬 病病毒基因組包括：根據(jù)狂犬病病毒SAD Bern全基因組序列，得到8個互補(bǔ)DNA片段F1~ F8 ;對所述的8個互補(bǔ)DNA片段F1~F8進(jìn)行人工合成，得到所述的狂犬病病毒基因組。
[0016] 特別是，在所述狂犬病病毒基因組F1段的5'端引入Pmel酶切位點(diǎn)和錘頭狀核酶 (HamRz)、在F8的3'端引入Notl酶切位點(diǎn)和丁肝病毒核酶。
[0017] 其中，所述的根據(jù)SAD Bern全基因組序列得到2個G基因包括：根據(jù)狂犬病病毒 SAD Bern全基因組序列，得到N基因、P基因、L基因和G基因；通過對所述G基因進(jìn)行擴(kuò) 增，得到所述的2個狂犬病病毒G基因；通過PCR重疊技術(shù)，將所述的2個狂犬病病毒G基 因串聯(lián)在一起，得到2G基因。
[0018] 其中，將2個G基因插入到所述狂犬病病毒基因組中包括：利用限制性內(nèi)切酶與連 接酶，將所述狂犬病病毒基因組及N基因、P基因、L基因、G基因分別連接到質(zhì)粒pcDNA中， 分別得到SAD Bern(Sanafox)基因組全長cDNA克隆質(zhì)粒pcDNA-SAD和輔助質(zhì)粒pcDNA-N、 pcDNA-P、pcDNA-L、pcDNA-G。將所述2G基因在所述克隆質(zhì)粒pcDNA-SAD中的G基因與L基 因之間進(jìn)行插入，獲得含有3G基因的重組全長質(zhì)粒pcDNA-SAD3-3G。
[0019] 特別是，在所述克隆質(zhì)粒pcDNA-SAD的在G基因和L基因之間引入BsiW I和Nhe I酶切位點(diǎn)，便于連接2G基因。
[0020] 特別是，所述重組狂犬病病毒株的構(gòu)建及培養(yǎng)方法還包括：將所述輔助質(zhì)粒 pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L、pcDNA-G和質(zhì)粒pcDNA-SAD-3G進(jìn)行混合，并加入轉(zhuǎn)染試劑，共 同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，得到重組病毒；對重組病毒進(jìn)行RT-PCR鑒定、序列測定及純化，獲得重組 病毒株。
[0021] 特別是，隨所述質(zhì)粒 pcDNA-SAD-3G 和質(zhì)粒 pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L、pcDNA-G 進(jìn) 行混合的混合比例為30-50:8-12:3-7:1-5:0. 5-1. 5。
[0022] 特別是，所述共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，還包括：進(jìn)行所述共同感染前，對宿主細(xì)胞用含 有10%牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并在轉(zhuǎn)染前一天，將BSR細(xì)胞以4X 105個細(xì)胞/孔的細(xì) 胞密度接種到6孔板中，使培養(yǎng)細(xì)胞生長至80 %~90 %單層。
[0023] 其中，所述宿主細(xì)胞選自BSR細(xì)胞、mNA細(xì)胞或BHK-21細(xì)胞中的一種。
[0024] 特別是，所述共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞還包括：對轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞進(jìn)行凍融處理，對凍 融后的宿主細(xì)胞進(jìn)行盲代培養(yǎng)后，與抗體進(jìn)行反應(yīng)，得到具有感染性的重組病毒株。
[0025] 特別是，所述凍融處理為2~3次，以便釋放細(xì)胞中的病毒。
[0026] 特別是，所述盲代培養(yǎng)為2~3代。
[0027] 其中，將所述制得具有感染性的重組狂犬病病毒置于-70~-79°C的溫度條件下 保存。
[0028] 本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在以下方面：
[0029] 1、本發(fā)明的重組狂犬病病毒株，在對狂犬病病毒SAD Bern全基因組序列進(jìn)行反向 遺傳操作而獲得的狂犬病病毒基因組中插入2個狂犬病病毒G基因后，具有優(yōu)良的免疫原 性，滅活的重組病毒可誘導(dǎo)比野生型更高的中和抗體水平，可以作為人和動物的狂犬病滅 活疫苗種毒株。
[0030] 2、本發(fā)明的重組狂犬病病毒株的構(gòu)建及培養(yǎng)方法簡單，拯救效率高，適用性廣。
【附圖說明】
[0031] 圖1是本發(fā)明所述的3G基因的SAD Bern基因組的構(gòu)建過程；
[0032] 其中：a是本發(fā)明所述的狂犬病病毒SAD Bern全基因組序列F1~F8,以及是構(gòu)建 全長需要的酶切位點(diǎn)示意圖；b是本發(fā)明所述的將2G基因插入到狂犬病病毒SAD Bern全 基因組序列F1~F8中構(gòu)建重組狂犬病毒的基因組示意圖。
[0033] 圖2是實(shí)施例1的中間接免疫熒光檢測結(jié)果；
[0034] 其中，A為SAD B感染BSR細(xì)胞的間接免疫熒光檢測結(jié)果；B為RV-r3G感染BSR細(xì) 胞間接免疫熒光檢測結(jié)果；C為BSR細(xì)胞陰性對照間接免疫熒光檢測結(jié)果。
[0035] 圖3是實(shí)施例1的RT-PCR檢測3G重組病毒；的檢測結(jié)果
[0036] 其中，Linel 和 line 2 為 RV-r3G 重組病毒；3. DNA Marker ;
[0037] 圖4是實(shí)施例1的SAD Bern和RV-r3G (重組狂犬病毒）在mNA⑷和BSR (B)上 的生長動力學(xué)曲線；
[0038] 圖5是實(shí)施例4的中和抗體滴度試驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 材料：pCAGGS購自拓飛生物科技有限公司；pcDNA3. 1購自life technology ; BSR細(xì)胞（ATCC CCL-10)、mNA(CCL-131)購自ATCC ;培養(yǎng)基分別為含10%胎牛血清的 DMEM(GIBCO)和 MEM(GIBCO)。
[0040] 試劑：Trizol Reagent、Pfx DNAPolymerase、Zero Blunt PC