微桿菌來源的桃膠多糖裂解酶及其分離純化方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離純化與酶學(xué)特性研宄及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種微桿 菌來源的桃膠多糖裂解酶及其分離純化方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 桃膠系桃、李、杏、櫻桃等薔薇科植物樹干受機械傷（如蟲咬、切傷等）或致病后分 泌出來的膠質(zhì)半透明物質(zhì)，為多糖類物質(zhì)，由半乳糖和阿拉伯糖構(gòu)成其多糖骨架的主要成 分。桃膠已被用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
[0003] 近年來，低聚糖因具有抗凝血、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等生物學(xué)活性而備受關(guān)注，成 為糖生物學(xué)新的研宄熱點。利用酶解法加工原桃膠，不僅可以使原桃膠分解、生產(chǎn)具有廣泛 工業(yè)用途的可溶性商品桃膠，更可以使桃膠多糖的骨架裂解，獲得功能性低聚糖。利用酶解 法加工原桃膠，先決條件在于得到能裂解原桃膠的酶以及該酶在以桃膠為底物時的最佳酶 解條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種微桿菌來源的桃膠 多糖裂解酶的分離純化方法。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述分離純化方法得到的微桿菌來源的桃膠多 糖裂解酶。
[0006] 本發(fā)明的再一目的在于提供所述微桿菌來源的桃膠多糖裂解酶的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種微桿菌來源的桃膠多糖裂解酶的分離 純化方法，包括如下步驟：
[0008] (1)菌種的馴化：
[0009] ①第一次馴化：將微桿菌A5種子液接種到含有質(zhì)量百分比2%桃膠的LB培養(yǎng)基 中，于搖床中培養(yǎng)至桃膠溶解，得到第一次馴化液；
[0010] ②第二次馴化：將第一次馴化液接種到含有質(zhì)量百分比4%桃膠的LB培養(yǎng)基中， 于搖床中培養(yǎng)至桃膠溶解，得到第二次馴化液；
[0011] ③第三次馴化：將第二次馴化液接種到含有質(zhì)量百分比6%桃膠的LB培養(yǎng)基中， 于搖床中培養(yǎng)至桃膠溶解，得到第三次馴化液；
[0012] ④第四次馴化：將第三次馴化液接種到含有質(zhì)量百分比8%桃膠的LB培養(yǎng)基中， 于搖床中培養(yǎng)至桃膠溶解，得到第四次馴化液；
[0013] ⑤第五次馴化：將第四次馴化液接種到含有質(zhì)量百分比10%桃膠的LB培養(yǎng)基中， 于搖床中培養(yǎng)至桃膠溶解，得到馴化好的種子液；
[0014] (2)發(fā)酵培養(yǎng)：將馴化好的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于搖床中培養(yǎng)至桃膠完 全溶解；發(fā)酵培養(yǎng)基為含有質(zhì)量百分比6%桃膠的LB培養(yǎng)基，初始pH值為6 ;
[0015] (3)分離純化：
[0016] ①將發(fā)酵液離心，去除菌體，取上清；
[0017] ②在上清中加入硫酸銨至飽和，于4°C靜置過夜；離心收集沉淀，隨后用磷酸緩沖 液將沉淀復(fù)溶；接著用磷酸緩沖液進行透析，期間更換磷酸緩沖液數(shù)次直至透析完全；透 析結(jié)束后，透析液離心除去不溶雜蛋白，收集上清液待純化；
[0018] ③將步驟②得到的上清液上樣到苯基瓊脂糖凝膠6FF(PhenylSepharose6Fast Flow)柱中，收集第二個穿柱峰；
[0019] ④對第二個穿柱峰上樣到ToyopearlDEAE-650S柱中，接著用磷酸緩沖液進行平 衡，而后再用〇. 6MNaCl溶液進行洗脫，收集第一個洗脫峰；
[0020] ⑤將第一個洗脫峰透析后凍干，得到桃膠多糖裂解酶。
[0021] 步驟（1)①中所述的微桿菌A5已在專利號為"200910193340.X"、名稱為"桃膠分 解酶生產(chǎn)菌株及其在制備桃膠多糖中的應(yīng)用"中公開；
[0022] 步驟（1)①中所述的微桿菌A5種子液優(yōu)選通過如下步驟得到：首先將微桿菌A5 于LB平板上劃線；再挑菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，搖床中進行培養(yǎng)，得到微桿菌A5種子 液；
[0023] 本發(fā)明中所述的搖床的條件優(yōu)選設(shè)置為28~30°C、180~200rpm;更優(yōu)選為 30°C、180rpm;
[0024] 步驟⑴中所述的接種的量優(yōu)選為體積百分比7. 5% ;
[0025] 步驟⑵中所述的接種的量優(yōu)選為體積百分比10%;
[0026]步驟（3)中所述的離心的條件優(yōu)選為4°C、lOOOOrpm離心20min;
[0027] 步驟（3)②中所述的磷酸緩沖液優(yōu)選為20mmol/L、pH6. 0的磷酸緩沖液；
[0028] 步驟（3)②中所述的透析完全為往磷酸緩沖液中滴入硝酸銀溶液時無沉淀；
[0029] 步驟（3)③中所述的第二個穿柱峰的獲得條件優(yōu)選為：使用規(guī)格為01OX 200mm的苯基瓊脂糖凝膠6FF層析柱，上樣流速為1. 0ml/min，紫外檢測器的檢測條件為 280nm；
[0030] 步驟（3)④中所述的上樣的速度優(yōu)選為1. 0ml/min;
[0031] 步驟（3)④中所述的磷酸緩沖液的平衡的速度優(yōu)選為1. 0ml/min;所述的磷酸緩 沖液優(yōu)選為pH6、20mM的磷酸緩沖液；
[0032] 步驟（3)④中所述的洗脫的速度優(yōu)選為1. 0ml/min;
[0033] 步驟（3)④中所述的洗脫峰為通過280nm的紫外檢測器進行監(jiān)測。
[0034] 一種微桿菌來源的桃膠多糖裂解酶，通過上述分離純化方法得到。
[0035] 所述的微桿菌來源的桃膠多糖裂解酶用于裂解桃膠，使用條件優(yōu)選為：30~ 40°C、pH值為5~7的磷酸緩沖液；更優(yōu)選為30°C、pH值為6的磷酸緩沖液；最優(yōu)選為30°C、 pH值為6的磷酸緩沖液，配以ImM的K+、Ca2+和Mn2+中的一種或至少兩種離子，或配以10mM 的Na+和Mg2+中的一種或兩種離子。
[0036] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：
[0037](1)本發(fā)明提供的方法在發(fā)酵之前先經(jīng)過2%、4%、6%、8%、10%桃膠質(zhì)量百分 比的前期馴化，有利于誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生桃膠多糖裂解酶；然后以質(zhì)量百分比6%原桃膠的發(fā) 酵液進行發(fā)酵產(chǎn)酶；接著通過PhenylSepharoseFastFlow將發(fā)酵上清液中的疏水性蛋 白進行吸附起到除去雜蛋白的目的，具有分解桃膠多糖的裂解酶以穿柱液的形式保留在穿 柱液中，結(jié)合ToyopearlDEAE-650S的使用，將具有分解桃膠多糖活性的裂解酶吸附在柱子 上，利用濃度為〇. 6M的NaCl溶液進行洗脫，得到具有活性的裂解酶，而且利用本方法制取 分解桃膠多糖的裂解酶國內(nèi)外文獻還沒有報道。
[0038] (2)本發(fā)明提供的方法不僅操作方便，而且通過該方法得到的桃膠多糖裂解酶能 保持酶活。
[0039] (3)本發(fā)明提供的桃膠多糖裂解酶的使用條件是該桃膠多糖裂解酶的最佳反應(yīng)條 件，能很好地分解原桃膠。
【附圖說明】
[0040] 圖1是HPLC對酶解產(chǎn)物進行分析時標(biāo)準(zhǔn)糖類的圖譜圖。
[0041] 圖2是酶解反應(yīng)時對照組樣品的HPLC分析結(jié)果圖。
[0042] 圖3是酶解反應(yīng)時反應(yīng)組樣品的HPLC分析結(jié)果圖。
[0043] 圖4是溫度對桃膠多糖裂解酶活性的影響的結(jié)果圖。
[0044] 圖5是pH值對桃膠多糖裂解酶活性的影響的結(jié)果圖。
[0045] 圖6是金屬離子及抑制劑對酶催化活性的影響的結(jié)果圖。
[0046] 圖7是桃膠多糖裂解酶作用于底物桃膠的米氏方程圖。
[0047] 圖8是桃膠多糖裂解酶作用于底物桃膠的雙倒數(shù)圖。
【具體實施方式】
[0048] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0049] 實施例
[0050] 一、制備桃膠裂解酶
[0051] (1)菌體的前期馴化：用接種針挑取試管斜面保藏的菌株（微桿菌A5,已在專利 號為"200910193340.X"、名稱為"桃膠分解酶生產(chǎn)菌株及其在制備桃膠多糖中的應(yīng)用"中 公開）于LB平板培養(yǎng)基上劃線，隨后將平板放置于30°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待平板上 長出單克隆，挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)基中，于180rpm、30°C的搖床中培養(yǎng)，作為第一次馴 化的種子液。第一次馴化，培養(yǎng)基為含有質(zhì)量百分比2%桃膠的LB培養(yǎng)基（500mL三角瓶 裝液量為150mL)，接入種子液20mL，于180rpm、30°C的搖床中培養(yǎng)至桃膠溶解；第二次馴 化，培養(yǎng)基為含有質(zhì)量百分比4%桃膠的1^培養(yǎng)基（50〇1^三角瓶裝液量為15〇11^)，接入第 一次馴化液20mL，于180rpm、30°C的搖床中培養(yǎng)至桃膠溶解；第三次馴化，培養(yǎng)基為含有質(zhì) 量百分比6%桃膠的1^培養(yǎng)基（50〇1^三角瓶裝液量為15〇1^)，接入第二次馴化液2〇1^， 于180rpm、30°C