對應(yīng)于轉(zhuǎn)基因事件mon87769的大豆植物和種子及其檢測方法
【專利說明】對應(yīng)于轉(zhuǎn)基因事件M0N87769的大豆植物和種子及其檢測 方法
[0001] 本申請是申請日為2009年2月12日、申請?zhí)枮?00980104350.X、發(fā)明名稱為"對 應(yīng)于轉(zhuǎn)基因事件M0N87769的大豆植物和種子及其檢測方法"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請的交叉引用
[0003] 本申請要求享有于2008年2月15日提交的美國臨時(shí)申請61/029, 197的優(yōu)先權(quán)， 該臨時(shí)申請的全部公開內(nèi)容通過引用并入本申請中。
[0004] 計(jì)算機(jī)可讀形式序列表的引入
[0005] 序列表是本發(fā)明公開內(nèi)容的一部分，包括計(jì)算機(jī)可讀形式的37KB的文件，名稱為 "M0NS193W0_ST25.txt"，包括本發(fā)明的核苷酸序列。序列表的主題通過引用完整并入本申 請中。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 1?技術(shù)領(lǐng)域
[0008] 本發(fā)明涉及包含事件（轉(zhuǎn)化事件）M0N87769的轉(zhuǎn)基因大豆植物、后代植物及其種 子。該事件顯示出包含十八碳四烯酸（stearidonicacid)的油組成。本發(fā)明還涉及檢測 所述大豆事件在生物樣品中的存在的方法，并提供該事件所特有的核苷酸序列。
[0009] 2.相關(guān)技術(shù)描述
[0010] 大豆是一種重要的農(nóng)作物，并且是世界許多地區(qū)的主要食物來源。生物技術(shù)方法 已經(jīng)被應(yīng)用于大豆以改進(jìn)農(nóng)藝學(xué)性狀和產(chǎn)品質(zhì)量。一種這樣的質(zhì)量性狀是包含十八碳四烯 酸（SDA)的大豆油。
[0011] 能夠檢測特定植物的轉(zhuǎn)基因/基因組DNA的存在以確定有性雜交的后代是否含有 目標(biāo)轉(zhuǎn)基因/基因組DNA是有利的。此外，當(dāng)遵守要求上市前審批及對源自重組作物的食 品進(jìn)行標(biāo)注的規(guī)定時(shí)，檢測特定植物的方法是有用的。
[0012] 已知多不飽和脂肪酸（PUFA)在食用后提供健康益處。含有SDA(-種PUFA)的油 作為人和其它動物的健康飲食的一部分將是有利的。SDA可以來自植物和動物來源。SDA 的商業(yè)來源包括植物屬毛束草屬（Trichodesma)、琉璃苣屬（Borago)(琉璃苣）和藍(lán)薊屬 (Echium)以及魚。但是，從天然來源商業(yè)生產(chǎn)PUFA有幾個(gè)缺點(diǎn)。PUFA的天然來源，如動物 和植物，常常具有高度不均勻的油組成。從這些來源獲得的油因此可能需要充分的純化來 分離出一種或多種需要的PUFA或產(chǎn)生富含一種或多種PUFA的油。PUFA的天然來源在可獲 得性上也有不可控制的波動。魚類資源可能遭受自然變化或者可能由于過度捕撈而消耗。 魚油也具有討厭的味道和氣味，因此經(jīng)濟(jì)地分離出需要的產(chǎn)品也許是不可能的，并且可能 使這些產(chǎn)品作為食品補(bǔ)充物是不可接受的。動物油，特別是魚油，可能積累環(huán)境污染物。食 物可以富含魚油，但是由于成本問題和世界上魚類資源的減少，這種富含可能存在問題。盡 管如此，如果社會上包括提高魚肉攝取的健康信息，則在滿足魚肉需求上可能會出現(xiàn)問題。 而且，這一產(chǎn)業(yè)的水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料嚴(yán)重依賴于野生魚類資源，其可持續(xù)性也存在問題（Naylor 等人，Nature405 :1017-1024, 2000)。
[0013] 因此，在基于陸地的陸地作物系統(tǒng)中生產(chǎn)PUFA如SDA將是有利的，可以操作該 系統(tǒng)以提供商業(yè)產(chǎn)量的SDA的生產(chǎn)。在諸如油菜、大豆、玉米、向日葵、紅花或亞麻等商業(yè) 油籽作物中，某些代表其種子油的單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸部分轉(zhuǎn)化為SDA需要 A6-去飽和酶和A15-去飽和酶的種子特異性的表達(dá)。來源于表達(dá)高水平A6-和A15-去 飽和酶的植物的油富含SDA。由于人和動物也需要提高Q-3脂肪酸攝取，因此需要提供多 種富含Q-3的食品和食品補(bǔ)充物，使得接受者可以選擇適合他們的日常飲食習(xí)慣的飼料、 飼料成分、食品和食品成分。在大豆植物中提供商業(yè)產(chǎn)量的SDA也是有利的。
[0014] 已知外來基因在植物中的表達(dá)受其染色體位置的影響，可能是由于染色質(zhì)結(jié)構(gòu) (如異染色質(zhì)）或靠近整合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件（如增強(qiáng)子）的接近性（Weising等人，Ann. Rev.Genet22:421-477,1988)。基于這個(gè)原因，通常需要篩選大量的事件以判斷以引入的 目標(biāo)基因的最佳表達(dá)為特征的事件。例如，在植物和其它生物中已觀察到：引入基因的表達(dá) 水平在事件之間差異很大。在表達(dá)的空間或時(shí)間模式上也有差異，例如，轉(zhuǎn)基因在各種不同 植物組織中的相對表達(dá)的差異，這可能不符合從引入的基因構(gòu)建體中存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 預(yù)期的模式?；谶@個(gè)原因，通常產(chǎn)生數(shù)百至數(shù)千個(gè)不同的事件，并對這些事件進(jìn)行篩選， 以選擇具有所需轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和用于商業(yè)目的的模式的單一事件。具有理想的轉(zhuǎn)基因表 達(dá)水平或模式的事件可以用于通過使用傳統(tǒng)育種方法的有性遠(yuǎn)交將轉(zhuǎn)基因滲入其它遺傳 背景中。這種雜交的后代保持原轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征。這一策略用來確保適當(dāng)?shù)剡m應(yīng) 當(dāng)?shù)靥囟ㄉL條件的許多品種中的可靠的基因表達(dá)。
[0015] 可以通過任何公知的核酸檢測方法如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)或使用核酸探針的DNA 雜交來檢測轉(zhuǎn)基因的存在。這些檢測方法一般集中于經(jīng)常使用的遺傳元件，如啟動子、終止 子、標(biāo)記基因等。因此，這些方法可能不是事件特異性的（例如，可用于區(qū)分不同的事件）， 特別是使用相同的DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的那些，除非鄰近插入的DNA的染色體DNA("側(cè)翼DNA"） 的序列是已知的。例如，Taverniers等人（J.Agric.FoodChem.，53 :3041_3052, 2005)討 論了事件特異性的PCR分析方法，其中證明了用于轉(zhuǎn)基因玉米株系Btll、Btl76和GA21及 用于油菜（canola)事件GT73的事件特異性追蹤系統(tǒng)。在這項(xiàng)研究中，事件特異性的引物 和探針基于各事件的基因組/轉(zhuǎn)基因接點(diǎn)（junction)的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。負(fù)責(zé)批準(zhǔn)使用包 含給定轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因植物的管理機(jī)構(gòu)也可能需要事件特異性檢測方法。轉(zhuǎn)基因植物事 件特異性的DNA檢測方法也已在美國專利6, 893, 826、6, 825, 400、6, 740, 488、6, 733, 974、 6, 689, 880、6, 900, 014 和 6, 818, 807 中描述。
[0016] 發(fā)明概述
[0017] 本發(fā)明涉及包含被稱為M0N87769的轉(zhuǎn)基因大豆事件的大豆植物及其與大豆事件 M0N87769不可區(qū)分的后代（這些后代也含有至少一個(gè)對應(yīng)于插入的轉(zhuǎn)基因DNA的等位基 因）。本發(fā)明的另一方面是包含大豆事件M0N87769的后代植物、或種子、或大豆植物和種子 的可再生部分。本發(fā)明也包括包含大豆事件M0N87769的植物的部分，該植物部分包括但不 限于：花粉、胚珠、花、芽、根、莖、葉、莢、種子和分生組織。包含M0N87769的植物基因組中含 有的新型遺傳組合物和來自包含M0N87769的植物的產(chǎn)品，如油、粗粉、面粉、食品、蛋白質(zhì) 補(bǔ)充劑和殘留在已收獲對應(yīng)于M0N87769的大豆植物的田地中的生物質(zhì)，是本發(fā)明的方面。
[0018] 本發(fā)明提供具有包含SDA的油組成的大豆植物，該植物具有包含事件M0N87769的 大豆植物的所有生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了用于檢測來自包含SEQIDN0 :1和/或SEQIDN0 : 2的新型大豆植物的轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域或被稱為M0N87769的事件是否存在的組合 物和方法，其中包含大豆事件M0N87769的種子的樣品以ATCC保藏號PTA-8911保藏。提供 了包含事件M0N87769的至少一個(gè)接頭序列（junctionsequence)的DNA序列，該接頭序列 選自SEQIDN0:1( "[A]SEQIDN0:1"，對應(yīng)于"[F]SEQIDN0:6" 的 979 位至 998 位，如 圖 2 所示）和SEQIDNO:2( " [B]SEQIDNO:2"，對應(yīng)于 " [F]SEQIDNO:6" 的 8345 位至 8365位，如圖2所示）及其互補(bǔ)序列；其中該接頭序列是跨越插入基因組中的異源DNA與 大豆細(xì)胞基因組DNA的連接點(diǎn)的核苷酸序列，在含有大豆DNA的生物樣品中檢測到該序列 可以判斷（diagnosticfor)大豆事件M0N87769DNA在所述樣品中的存在。這些接頭序列 至少含有SEQIDN0:1和/或SEQIDN0:2和/或其互補(bǔ)序列。包含這些DNA分子的大豆 事件M0N87769和大豆種子是本發(fā)明的一方面。
[0020] 來自大豆事件M0N87769的包含新型轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域的DNA序列SEQID N0:3[C]、SEQIDN0:4[D]和SEQIDN0:5[E]或SEQIDN0:1[A]、SEQIDN0:2[B]和SEQ IDNO:5[E](參見圖2)也是本發(fā)明的方面。包含這些分子的大豆植物和種子也是本發(fā)明 的方面。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于DNA檢測方法的兩個(gè)DNA分子，其中，第一DNA 分子包含SEQIDN0 :3或SEQIDN0 :5的DNA分子的轉(zhuǎn)基因區(qū)域任何部分的至少11個(gè)或 更多連續(xù)多核苷酸，以及類似長度的SEQIDN0 :3的5'側(cè)翼大豆基因組DNA區(qū)域的任何部 分的DNA分子，其中，這些DNA分子一起使用時(shí)用作產(chǎn)生擴(kuò)增子的DNA擴(kuò)增方法中的DNA引 物。當(dāng)擴(kuò)增子包含SEQIDN0 :1時(shí)，在DNA擴(kuò)增方法中使用這些DNA引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子可 判斷大豆事件M0N87769。使用與SEQIDN0:3和SEQIDN0:5的任何部分同源或互補(bǔ)的 DNA引物產(chǎn)生的任何擴(kuò)增子及任何包含SEQIDN0 :1的擴(kuò)增子是發(fā)明的一方面。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于DNA檢測方法的兩個(gè)DNA分子，其中，第一DNA 分子包含SEQIDN0 :4或SEQIDN0 :5的DNA分子的轉(zhuǎn)基因區(qū)域任何部分的至少11個(gè)或 更多連續(xù)多核苷酸，以及類似長度的SEQIDN0 :4的3'側(cè)翼大豆基因組DNA區(qū)域的任何部 分的DNA分子，其中，這些DNA分子用作DNA擴(kuò)增方法中的DNA引物。當(dāng)擴(kuò)增子包含SEQID NO:2時(shí)，在DNA擴(kuò)增方法中使用這些DNA引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子可判斷大豆事件M0N87769。使 用與SEQIDN0:4和SEQIDN0:5的任何部分同源或互補(bǔ)的DNA引物產(chǎn)生的任何擴(kuò)增子及 任何包含SEQIDN0 :2的擴(kuò)增子是發(fā)明的一方面。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了檢測樣品中對應(yīng)于大豆事件M0N87769的DNA的存 在的方法。這些方法包括：(a)使包含DNA的樣品與引物組接觸，該引物組在與來自大豆事 件M0N87769的基因組DNA的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用時(shí)產(chǎn)生可判斷大豆事件M0N87769的擴(kuò)增 子；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生擴(kuò)增子；和（c)檢測所述擴(kuò)增子，其中所述擴(kuò)增子包含 SEQIDN0 :1 和 / 或SEQIDN0 :2。
[0024] 本發(fā)明的另一方面是包含事件M0N87769的大豆植物或種子，或得自該植物或種 子的產(chǎn)物，其中，基因組DNA包含基本上由SEQIDN0 :3的大約1至988位的核苷酸序列、 SEQIDN0:5的大約1至7367位的核苷酸序列和SEQIDN0:4的大約1至939位的核 苷酸序列（其疊連群作為SEQIDN0 :6呈現(xiàn)）及其互補(bǔ)序列組成的DNA分子。包含事件 M0N87769的大豆植物或種子，或得自該植物或種子的產(chǎn)物（其中基因組DNA當(dāng)從該大豆植 物或種子或產(chǎn)物分離時(shí)，包含并入了SEQIDN0 :1和/或SEQIDN0 :2的DNA分子）也是 本發(fā)明的一方面。
[0025] 本發(fā)明的另一方面是包含事件M0N87769的大豆植物或種子，或得自該植物或種 子的產(chǎn)物，其中，基因組DNA包含基本上由SEQIDN0 :6的大約1至9294位的核苷酸序列 及其互補(bǔ)序列組成的DNA分子。也提供了大豆植物或種子，或得自該植物或種子的產(chǎn)物，其 中，基因組DNA當(dāng)從該大豆植物或種子或產(chǎn)物分離時(shí)，包含并入了SEQIDN0 :1和/或SEQ IDN0 :2及其互補(bǔ)序列的DNA分子。
[0026] 本發(fā)明的另一方面是M0N87769的大豆植物或種子，或得自該植物或種子的產(chǎn)物， 其中，基因組DNA當(dāng)從該大豆植物或種子或產(chǎn)物分離時(shí)，在DNA擴(kuò)增方法中產(chǎn)生擴(kuò)增子，其 中所述擴(kuò)增子包含SEQIDN0 :1和/或SEQIDN0 :2。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了檢測對應(yīng)于M0N87769事件的DNA在樣品中是否存 在的方法，這樣的方法包括：(a)使包含DNA的樣品接觸在嚴(yán)格雜交條件下與來自大豆事件 M0N87769的基因組DNA雜交且在嚴(yán)格雜交條件下不與對照大豆植物雜交的探針；(b)使所 述樣品和探針經(jīng)歷嚴(yán)格雜交條件；和（c)檢測所述探針與大豆事件M0N87769DNA的雜交， 其中，所述探針選自SEQIDN0:1和/或SEQIDN0:2。
[0028] 本發(fā)明的另一方面是一種測定大豆事件M0N87769的后代的接合性的方法，該方 法包括：（a)使包含大豆DNA的樣品接觸引物組SQ5923(SEQIDNO:8)、SQ5924(SEQIDN0 : 9)、SQ5925(SEQIDN0:11)和探針組 6FAM?-標(biāo)記的PB2511(SEQIDN0:10)和VIC?-標(biāo)記 的PB2512(SEQID勵：12)，所述引物組在與來自包含大豆事件腸呢7769的植物的基因組