黃曲霉毒素b1核酸適配體及其在樣品磁分離中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種黃曲霉毒素B1核酸適配體及其在樣品 磁分離中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的危害因子中真菌毒素的污染是最主要的因素之一。黃曲霉 毒素（Aflatoxins，AF)作為一種天然污染源主要存在于花生、玉米、大米、小麥、牛奶、棉籽 和各種堅果以及飼料中，是一類化學結(jié)構(gòu)相似的真菌毒素的總稱，屬二呋喃氧雜萘鄰?fù)?衍生物，目前已發(fā)現(xiàn)20多種，主要包括81、82、61、6211和112等。4?81是迄今發(fā)現(xiàn)毒性最 強的真菌毒素，其毒性較氰化鉀強10倍，較砒霜強68倍，主要損傷肝臟等器官誘發(fā)肝癌，已 經(jīng)成為人類肝癌發(fā)病的重要因素并被世界衛(wèi)生組織認定為一類致癌物。AFB1理化性質(zhì)比較 穩(wěn)定，具有脂溶性，耐高溫，難去除，對人畜健康是一種潛在的嚴重威脅。國際上食品衛(wèi)生和 農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中AFB1含量是必檢指標，目前世界各國都制定了食品中AF允許量的國家標準， 因此開展針對AFB1的識別及檢測研究具有重要的科學意義及應(yīng)用價值。
[0003] 目前，世界上通用的AF檢測方法主要分兩大類：化學分析法和免疫分析法。薄層 色譜法（TLC)、微柱法、高效液相色譜法（HPLC)等屬于化學分析法，這些檢測方法靈敏度 高、準確度好，但是樣品前處理復(fù)雜、檢測較為耗時、儀器設(shè)備比較貴重，且對檢測人員具有 較高的技術(shù)要求。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)靈敏、安全、快捷、抗干擾，是目前普遍實用的 AF免疫檢測方法，然而AF這類小分子毒性較高，抗體制備周期長、技術(shù)難度大、批間差異 大，且制備好的抗體不易保存、易失活，這些缺點大大限制了免疫學分析方法的推廣和快速 發(fā)展。核酸適配體作為一類單鏈寡核苷酸，被稱作"化學抗體"，與抗體相比具有靶標范圍 廣（甚至是毒性靶標）、可體外制備、開發(fā)周期短、生產(chǎn)成本低、特異性高、穩(wěn)定性好、品質(zhì)均 一、批間差異小且易于化學合成和修飾等優(yōu)點。
[0004] 目前，基于核酸適配體的快速檢測技術(shù)研發(fā)越來越熱，在醫(yī)學檢測領(lǐng)域已經(jīng)非 常廣泛，而在真菌毒素檢測方面的應(yīng)用報道還僅限于赭曲霉毒素A(OTA)和伏馬毒素 B1 (FBI)。因此，針對AF的分子識別元件核酸適配體的開發(fā)具有重要的研究意義和廣闊的 應(yīng)用前景，特別是其高度的靶分子識別特異性（能夠區(qū)分單個修飾基團的差別，如茶堿的 核酸適配體能夠區(qū)分可卡因與茶堿分子，二者只有一個甲基的差別），非常適合AF這類結(jié) 構(gòu)極其相似的小分子分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點與不足，提供一種黃曲霉毒素 B1核酸適配體，該核酸適配體能夠特異性識別黃曲霉毒素B1，其篩選過程采用自由態(tài)靶標 篩選策略即篩選過程保持黃曲霉毒素B1為游離狀態(tài)，不對其進行任何修飾。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述的黃曲霉毒素B1核酸適配體在樣品磁分離中的 應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種黃曲霉毒素B1核酸適配體，其核苷酸 序列如下所示：
[0008] CCTGCCACGCTCCGCAAGCTTATAGGGCACGTGTTGTCTTCCTGTGTCTCGTGCCCATCGCTAGGTTTA CATAAGCTTGGCACCCGCATCGT。
[0009] 所述的黃曲霉毒素B1核酸適配體具有如圖6所示的二級結(jié)構(gòu)。
[0010] 所述的黃曲霉毒素B1核酸適配體可以應(yīng)用于樣品磁分離。
[0011] 優(yōu)選的，所述的黃曲霉毒素B1核酸適配體可以應(yīng)用于樣品中黃曲霉毒素B1磁分 離。
[0012] 所述的黃曲霉毒素B1核酸適配體包括氨基修飾上述核苷酸序列的衍生序列，所 述的氨基修飾核酸序列的衍生序列具有與黃曲霉毒素B1核酸適配體原序列相同的從樣品 中進行黃曲霉毒素B1磁分離功能。
[0013] 所述的黃曲霉毒素B1核酸適配體應(yīng)用于樣品中黃曲霉毒素B1磁分離，包括如下 步驟：
[0014] (1)將氨基修飾的黃曲霉毒素B1核酸適配體交聯(lián)到羧基修飾的磁珠上；
[0015] (2)將修飾有黃曲霉毒素B1核酸適配體的磁珠與含有黃曲霉毒素B1的樣品提取 液混合，利用磁分離架富集磁珠，然后洗滌，最后洗脫得到純度濃度高的黃曲霉毒素B1。 [0016] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：
[0017] 1)本發(fā)明的黃曲霉毒素B1核酸適配體是通過自由態(tài)靶標篩選策略獲得，篩選過 程不涉及靶標分子的修飾，因此獲得的黃曲霉毒素B1核酸適配體具有更好的特異性。
[0018] 2)與抗體相比，黃曲霉毒素B1核酸適配體作為一種單鏈DNA，穩(wěn)定性好，便于保 存，易于修飾與標記，同時可以大量化學合成，批次間差異小，成本低廉。
【附圖說明】
[0019] 圖1是文庫在磁珠上的固定效果圖：A為裸磁珠突光顯微鏡成像圖；B為固定有突 光標記文庫復(fù)合物的磁珠熒光顯微鏡成像圖；
[0020] 圖2是篩選文庫親和力隨篩選輪次增加的變化情況結(jié)果圖；
[0021] 圖3是篩選文庫結(jié)合特異性考察結(jié)果圖；
[0022] 圖4是氨基修飾黃曲霉毒素B1核酸適配體在磁珠上的交聯(lián)結(jié)果圖：A為交聯(lián)后磁 分離之后的上清；B為黃曲霉毒素B1核酸適配體交聯(lián)之前的原液；
[0023] 圖5是黃曲霉毒素B1核酸適配體修飾磁珠的磁分離效果圖：A)為黃曲霉毒素B1 的500nM的乙腈水溶液（1:1) ;B)同濃度的黃曲霉毒素B1篩選緩沖液經(jīng)過黃曲霉毒素B1 核酸適配體修飾的磁珠捕獲-磁分離-洗脫后的乙腈水溶液（1 :1) ;C)為同濃度的黃曲霉 毒素B1篩選緩沖液經(jīng)過裸磁珠捕獲-磁分離-洗脫后的乙腈水溶液（1 :1);
[0024] 圖6是黃曲霉毒素B1核酸適配體的二級結(jié)構(gòu)圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0026] 實施例1
[0027] 黃曲霉毒素B1核酸適配體的自由態(tài)靶標篩選
[0028] 本實施例中所使用的SELEX單鏈DNA隨機文庫的設(shè)計為：兩端為引物固定序 列，中間為用于往磁珠上固定文庫的固定序列，兩端固定序列與中間固定序列之間各有 一段隨機文庫序列：5' -CCTGCCACGCTCCGCAAGCTT-N10-CTGCAGCGATTCTTGATCG-N20-TAAG CTTGGCACCCGCATCGT-3 '，庫容1014以上。該文庫設(shè)計與傳統(tǒng)的固定序列在兩端的設(shè)計 不同，一方面兩端的引物固定序列在篩選過程中采用短序列進行雜交封閉，避免了文庫 在與靶標結(jié)合過程中引物序列參與結(jié)合，同時具有更大的下游開發(fā)便利性，中間文庫固 定序列可以引入熒光標記短鏈序列，便于設(shè)計"結(jié)構(gòu)開關(guān)型"核酸適配體傳感器。所用 引物P1 :5' -Cy3-GCGGAGCGTGGCAGG-3,引物 2 :5' -ACGATGCGGGTGCCAAGCTTA-3'，引物 3 : 5, -C