過表達(dá)Galectin-1基因編碼蛋白永生化細(xì)胞的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種過表達(dá)Galectin-1基因永生化細(xì)胞系的制備方法，特別是涉及一種過表達(dá)Galectin-1基因編碼蛋白過表達(dá)BHK細(xì)胞系的制備方法，屬于生物技術(shù)和細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明具有深遠(yuǎn)的研宄性和廣泛的應(yīng)用性，包括研宄宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)具有穩(wěn)定性以及可表達(dá)所需蛋白的哺乳動物細(xì)胞的永生化，以及該過表達(dá)細(xì)胞系對狂犬病病毒增殖的滴度的影響。
【背景技術(shù)】
[0002]半乳糖凝集素(Galectin-1)也是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類蛋白，并且在各個感染組均呈較一致的下調(diào)表達(dá)。Galectin-1是自然界廣泛存在的一類選擇性識別糖結(jié)構(gòu)并與其非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)，是動物凝集素家族中的一員，存在于從線蟲、海綿到哺乳動物等各種動物體內(nèi)。Galectin-1大部分功能是在細(xì)胞表面和細(xì)胞外執(zhí)行，與受體的結(jié)合可以啟動多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與細(xì)胞黏附、生長調(diào)節(jié)和免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能。Galectin-1與CD7結(jié)合激活A(yù)P-1，并下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，這很可能是Calectin-1誘導(dǎo)凋亡的分子機制。1n等發(fā)現(xiàn)Galectin-1激發(fā)線粒體途徑的凋亡程序，它通過激起酸性神經(jīng)磷脂酶調(diào)節(jié)神經(jīng)胺酸的釋放，降低Bcl-2蛋白的產(chǎn)量，激活caspase 9和caspase 3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
[0003]重組Galectin-1能促進神經(jīng)細(xì)胞軸突的再生，這一過程可被相應(yīng)抗體強烈抑制。Galectin-1在神經(jīng)細(xì)胞中可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，其mRNA可在各種神經(jīng)元的細(xì)胞體中觀察到，如三叉神經(jīng)細(xì)胞、外展神經(jīng)細(xì)胞等，其在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平也可反映星型細(xì)胞瘤到膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性程度，這可能與本實驗選用的小鼠母神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a有一定相關(guān)性。
[0004]Galectin-1在病毒感染發(fā)生時可以發(fā)揮抑制作用，副粘病毒家族冠膜蛋白調(diào)節(jié)的細(xì)胞融合作用受到Galectin-1的抑制，表明其抗病毒作用。Galectin-1可作為HIV-1穩(wěn)定黏附到細(xì)胞表面的可溶性因子，誘導(dǎo)HIV-1感染的表面糖基化增加的T細(xì)胞凋亡。Rubinstein等通過反義核酸技術(shù)革El向性抑制腫瘤細(xì)胞中Galectin-1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，封閉Galectin-1基因會增強T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。我們通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也發(fā)現(xiàn)，Galectin-1在各個RV感染組與正常組比較中均呈下調(diào)表達(dá)，而在不同毒株感染組間表達(dá)水平基本一致，說明RV感染N2a細(xì)胞時Galectin-1的表達(dá)受到了抑制，進而調(diào)節(jié)了細(xì)胞的增殖，抵抗細(xì)胞凋亡的發(fā)生，有利于RV的持續(xù)性感染。另外，RV感染易感細(xì)胞系、小鼠腦組織以及犬外周血單核細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組學(xué)比較中也發(fā)現(xiàn)Galectin-1的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，這說明RV感染時Galectin-1可能發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種過表達(dá)Galectin-1基因永生化細(xì)胞系的制備方法，容易培養(yǎng)，增殖速度快速，可無限擴大，性質(zhì)穩(wěn)定，易保存，方法技術(shù)成熟，重復(fù)性強，一般研宄人員即可完成。具有遺傳穩(wěn)定性。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是一種過表達(dá)Galectin-1基因永生化細(xì)胞系的制備方法，首先設(shè)計針對Galectin-1基因的特異性引物，使用RT-PCR擴增鼠源Galectin-1整個編碼基因，然后連接PMD-18T載體，經(jīng)酶切和PCR鑒定正確后測序，測序正確后命名為pMD-Ga ；然后，酶切PMD-Ga獲得Galectin-1基因片段，相應(yīng)的克隆至真核表達(dá)載體pIRESneo的多克隆酶切位點中，再經(jīng)經(jīng)酶切和PCR鑒定正確獲得pIRESneo-Ga質(zhì)粒；大量制備高純度的PlRESneo-Ga質(zhì)粒使用FuGENE轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞系，經(jīng)G418抗性壓力篩選，獲得穩(wěn)定的細(xì)胞克隆，擴大培養(yǎng)后，再經(jīng)Western Blot驗證獲得過表達(dá)Galectin-1基因的穩(wěn)定的細(xì)胞系；具體步驟如下:
UGalectin-1 基因的 RT-PCR 擴增
根據(jù)GenBank中Galectin-1核苷酸序列設(shè)計并合成了下列引物上游 Galectin-1-F: 5’ -gatatctcaa tcatggcctg tggtc 下游 Galectin-1-R: 5’ -ggatcctgcc tttattgagg gctaca 用上述引物進行RT-PCR擴增得到450bp的片段；見圖1。
[0007]2、Galectin-1基因與pMD_18T載體的連接及測序
根據(jù)PMD-18T載體的說明書進行體外轉(zhuǎn)錄模板序列與骨架載體的連接。然后用酶切方法證明了體外轉(zhuǎn)錄載體的正確構(gòu)建見圖2 ;測序結(jié)果見序列I。
[0008]3、Galectin-1 基因與 pIRESneo 載體的連接
酶切連接在PMD-18T載體測序正確的Galectin-1基因片段，體外連接真核表達(dá)載體pIRESneo骨架，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞獲取重組子；然后用酶切方法證明了 pIRESneo-Ga質(zhì)粒的正確構(gòu)建，見圖3。
[0009]4、PIRESneo-Ga 質(zhì)粒的制備
用Luria-Bertani Medium培養(yǎng)基培養(yǎng)l_3ml濃度為1-1.5 OD6tltl值的含目的基因重組質(zhì)粒菌液，通過超純質(zhì)粒純化試劑盒制備無內(nèi)毒素的超純質(zhì)粒。
[0010]5、pIRESneo-Ga質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
用含5-10小牛血清的Minimum Essential Medium作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，重組pIRESneo-Ga質(zhì)粒經(jīng)FuGENE轉(zhuǎn)染試劑(Roche公司)介導(dǎo)傳染70-80%融合的生長旺盛的單層BHK細(xì)胞。
[0011]6、G418壓力篩選單克隆化細(xì)胞
在含500 μ g/ml濃度G418的Minimum Essential Medium的培養(yǎng)基中，通過極限稀釋法獲得單克隆化細(xì)胞，見圖4。
[0012]7、永生化細(xì)胞系的鑒定
單克隆化細(xì)胞經(jīng)RT-PCR、Western Blot檢測后，獲得含目的基因的永生化細(xì)胞。
[0013]本發(fā)明運用重組DNA技術(shù)、細(xì)胞重組技術(shù)，采用反轉(zhuǎn)錄PCR方法獲得了鼠源Galectin-1基因，以之為模板構(gòu)建了表達(dá)編碼蛋白的整合表達(dá)載體，經(jīng)FuGENE介導(dǎo)轉(zhuǎn)染70-80%融合的生長旺盛的單層BHK細(xì)胞，在G418抗性壓力和96孔板極限稀釋法克隆抗性單細(xì)胞，運用RT-PCR和Western Blot技術(shù)證實Galectin-1基因已成功轉(zhuǎn)染至BHK細(xì)胞，并整合到細(xì)胞的基因組中且過表達(dá)目的蛋白。
[0014]本發(fā)明的積極效果在于容易培養(yǎng)，增殖速度快速，可無限擴大，性質(zhì)穩(wěn)定，易保存，方法技術(shù)成熟，重復(fù)性強，一般研宄人員即可完成。
【附圖說明】
[0015]圖1 是 Galectin-1 基因 RT-PCR 擴增圖，1.Galectin-Ι 基因(450bp)M.DL2000 ；
圖2是Galectin-1基因連接pMD-Ga酶切鑒定圖，1.質(zhì)粒對照2.EcoR I酶切3.EcoRV 酶切 4.EcoR I+EcoR V 酶切 M.6280 Marker5.DL2000 ；
圖 3 是 Galectin-1 基因連接 pIRESneo-Ga 酶切鑒定圖，1.DL20002.EcoR V+BamH I3.Sma I
4.EcoR I 5.質(zhì)粒對照 6.6280 DNA Marker ；
圖4是G418壓力篩選單克隆細(xì)胞株圖；
圖5是Western Blot驗證Galectin-Ι基因過表達(dá)圖；
圖6是pIRESneo-Ga載體構(gòu)建過程圖。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步描述；這些實施例展示的是在G418壓力下過表達(dá)Galectin-Ι基因編碼蛋白永生化細(xì)胞系的建立，具有遺傳穩(wěn)定性。
[0017](一)pMD-Ga載體的構(gòu)建和測序
1、寡核苷酸引物的設(shè)計與合成
根據(jù)GenBank中Galectin-Ι核苷酸序列設(shè)計并合成了下列引物上游 Galectin-1-F: 5’ -GATATCTCAATCATGGCCTGTGGTC 下游 Galectin-1-R: 5’ -GGATCCTGCCTTTATTGAGGGCTACA
2、BHK細(xì)胞總RNA的提取
50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶的BHK細(xì)胞直接加ImL Trizol,室溫放置5min，使其充分裂解，12000r/min離心5min，取上清，按200 μ L氯仿/mL Trizol加入氯仿，振蕩混勾室溫放置15min，4°C 12 000r/min離心15min，吸上清，至另一離心管中，按0.5mL異丙醇/mL Trizol加入異丙醇混勻，室溫放置5?10min，4°C 12 000r/min離心lOmin，棄上清，RNA沉于管底。按ImL 75%乙醇/mL Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，4°C 12 OOOr/min離心lOmin，棄上清，室溫干燥后，加20 yL RNase-free的水溶解，一 80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0018]3、Galectin-Ι基因片段全長cDNA合成
總 RNA 5yL，70°C 加熱 lOmin，冰浴 5min，加 200U 反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV，25pmol/μ L 引物F、25pmol/yL 引物 R 及 10mmol/L dNTPs 各 I μ L，42°C反應(yīng) 60min，即得到 cDNA。70°C水浴 lOmin，滅活反轉(zhuǎn)錄酶。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 10 μ L，1XPCR buffer 4yL、25mmol/L MgCL24 μ L、引物 Galectin-l-F (25pmol/μ L)、Galectin_l-R (25pmol/μ L)及 lOmmol/L dNTPs各 0.5 μ L，加水 30 μ L，煮沸變性 1min,冰浴 5min，加 Taqplus DNA 聚合酶 0.25 μ L (5U/μ L)混勻，具體反應(yīng)條件為94°C變性30sec，57°C退火40sec、72°C延伸90sec，25個循環(huán)后72°C再延伸lOmin，以1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增效果。
[0019]4、Galectin-Ι基因片段克隆與序列測定
將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后直接克隆至PMD18-T載體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。通過氨芐青霉素抗性篩選，獲得重組質(zhì)粒命名為pMD-Ga。經(jīng)酶切和PCR初步鑒定后，陽性重組質(zhì)粒送交大連寶生物工程公司進行序列測定。
[0020]Galectin-Ι基因核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0021](二)pIRESneo-Ga真核表達(dá)載體的構(gòu)建 1、目的片段回收
稱取Ig瓊脂糖于10mL IXTAE中加熱溶解；冷卻至40-50°C時加入終濃度(V/V)為
0.1%的EB，混勻后倒膠；插入膠回收齒梳，室溫冷卻備用；將上樣混合物(90 μ L PCR產(chǎn)物+10 μ L 1XLoading Buffer)加于上樣孔中。以5V/cm的電壓，電泳至所需時間后，取出凝膠，在透射紫外燈上觀察，或拍照