用于轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體的改進(jìn)技術(shù)的制作方法
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明是申請(qǐng)?zhí)枮?01080057861. 3,申請(qǐng)日為2010年12月20日，發(fā)明名稱為"用 于轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體的改進(jìn)技術(shù)"的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及用于向植物細(xì)胞原生質(zhì)體中引入感興趣的外來分子的方法。發(fā)明還涉 及轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞原生質(zhì)體和用于實(shí)施所述方法的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0003] 遺傳改造是刻意創(chuàng)造活細(xì)胞遺傳物質(zhì)變化的方法，所述方法目的在于改造那種細(xì) 胞或者由細(xì)胞構(gòu)成其一部分的器官或由細(xì)胞再生的器官的一種或多種遺傳編碼的生物學(xué) 屬性。這些變化可以采取刪除部分遺傳物質(zhì)、加入外源性遺傳物質(zhì)或者像遺傳物質(zhì)中現(xiàn)有 核苷酸序列的替換的變化的形式。
[0004] 用于真核生物遺傳改造的方法為人們所知已超過20年，并且已發(fā)現(xiàn)其廣泛應(yīng)用 于植物和動(dòng)物細(xì)胞和微生物以改善農(nóng)業(yè)、人類健康、食品質(zhì)量和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域。
[0005] 遺傳改造的常見方法由向細(xì)胞基因組中加入外源性DNA片段組成，然后這將賦予 那種細(xì)胞或其有機(jī)體除了通過已經(jīng)現(xiàn)有的基因編碼的屬性以外的新的屬性（包括其中現(xiàn) 有基因的表達(dá)將因此被抑制的應(yīng)用）。盡管很多這樣的實(shí)例可以有效地獲得所需的屬性，但 是這些方法不是非常準(zhǔn)確，因?yàn)闊o法控制外源性DNA片段插入其中的基因組位置（并因此 無法控制最終的表達(dá)水平），并且因?yàn)樗璧男Ч麑⑵渥陨眢w現(xiàn)在由原始的且均衡的基因 組編碼的自然屬性之上。遇到的一個(gè)常見問題是，由于外源性DNA片段在宿主基因組DNA 中的隨機(jī)整合，必要或有利的基因被失活或修飾，造成宿主所需特征的不必要的損失。
[0006] 相反，將導(dǎo)致預(yù)定義的基因組基因座中核苷酸的加入、刪除或轉(zhuǎn)化的遺傳改造的 方法將允許現(xiàn)有基因的精確改造。
[0007] 隨著過去十年里基因組學(xué)的出現(xiàn)，現(xiàn)在有可能迅速且成本有效地地破譯動(dòng)物、植 物和細(xì)菌的基因組。這已經(jīng)導(dǎo)致大量的能夠與如動(dòng)物的疾病易感性或植物的產(chǎn)量特征的表 型有關(guān)的基因和調(diào)節(jié)序列。這將允許迅速建立序列的假定功能，但是一個(gè)基因?qū)σ环N觀察 到的表型負(fù)責(zé)的最終證明必須通過創(chuàng)建顯示預(yù)期的改變的表型的突變系來獲得。
[0008] 不同于動(dòng)物細(xì)胞，植物細(xì)胞由多糖和蛋白質(zhì)的混合物組成的厚厚的細(xì)胞壁包圍， 而動(dòng)物細(xì)胞可以輕易地服從外來分子的引入，植物細(xì)胞更加頑固并且需要稍微更加侵略性 的方法。為了向植物細(xì)胞中引入外來分子的現(xiàn)有技術(shù)程序可以分為2種類別。
[0009] 第一類重組了采用通過刺穿植物細(xì)胞壁向植物細(xì)胞中機(jī)械引入感興趣的分子的 所有方法。這能夠通過生物彈道遞送（biolisticsdelivery)來完成，其中將感興趣的分 子包被在金屬珠（金或鎢）上，使用氣體加壓裝置將其推進(jìn)到細(xì)胞中。然而，這種方法的效 率相當(dāng)?shù)筒⑶乙驗(yàn)椴皇撬械募?xì)胞都被轉(zhuǎn)化，選擇是必須的，其限制了目標(biāo)的數(shù)目。另一種 方法使用了連接到一個(gè)微型操縱器上的微-或納-針將化合物穿過細(xì)胞壁直接注射到植物 細(xì)胞中。然而，微注射需要特殊設(shè)備和大量技巧。該方法同樣是單調(diào)的和費(fèi)時(shí)的并且相較 于生物彈道遞送幾乎沒有提供優(yōu)勢(shì)。但另一種方法使用了碳納米管，其含有感興趣的分子 并且其末端包被有細(xì)胞壁消化酶。據(jù)說，納米管將局部地降解細(xì)胞壁并刺穿質(zhì)膜允許其內(nèi) 容物遞送進(jìn)入宿主細(xì)胞。雖然與微注射或生物彈道轟擊（biolisticsbombardment)相比 侵略性較低，上述限制也適用于此。
[0010] 第二類重組了其中在引入感興趣的分子之前用酶將整個(gè)植物細(xì)胞壁移除的所有 方法。細(xì)胞壁的完全移除破壞了細(xì)胞之間的聯(lián)系，產(chǎn)生了個(gè)體化細(xì)胞的均勻混懸物，其允許 更均勻和更大規(guī)模的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。這包括，但不僅限于，原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)染和聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。因此，原生質(zhì)體的制備是一種產(chǎn)生數(shù)百萬細(xì)胞的非?？煽亢?廉價(jià)的方法，并且由于其靈活性、效率和產(chǎn)量，通常比其它方法優(yōu)選。
[0011] 幾乎能夠從每一種植物組織中分離原生質(zhì)體。原生質(zhì)體的主要來源是葉肉組織， 其每克鮮重產(chǎn)生大量的原生質(zhì)體。其它組織類型的使用主要取決于現(xiàn)有程序?qū)τ谒紤]的 系統(tǒng)和實(shí)驗(yàn)最終目標(biāo)的可用性。
[0012] 許多生物學(xué)過程，若非全部，是空間上和時(shí)間上調(diào)節(jié)的。一個(gè)細(xì)胞都有其自己的 生物鐘，細(xì)胞周期是其最明顯的表現(xiàn)。每一個(gè)細(xì)胞將經(jīng)歷一系列發(fā)展階段如生長(zhǎng)（G0、G2)、 DNA復(fù)制（S)、分裂（M)和靜止（GO)。因此，當(dāng)設(shè)計(jì)意圖與特異性通路相互作用的實(shí)驗(yàn)時(shí)，其 與處理所考慮的系統(tǒng)狀態(tài)有關(guān)。感興趣的分子的引入必須要仔細(xì)地定時(shí)以便匹配研究的方 法。感興趣的分子或者必須在很長(zhǎng)一段時(shí)間里在細(xì)胞環(huán)境中保持穩(wěn)定直至它可以執(zhí)行其活 性或者必須在所研究的方法開始之前不久被遞送。例如，在通過向細(xì)胞中引入標(biāo)記的微管 蛋白早前期帶（pre-prophaseband)形成期間的微管動(dòng)力學(xué)研究中，必須確定的一點(diǎn)是微 管蛋白在早前期帶的形成之前不久被遞送，除非標(biāo)記的微管蛋白足夠穩(wěn)定以抵擋酶降解直 至早前期帶形成開始。對(duì)于特定的實(shí)例，另一個(gè)考慮是向結(jié)構(gòu)中而非早前期帶中并入熒光 微管蛋白，并因此需要在所需的時(shí)間遞送探針。
[0013] 不幸的是，除了細(xì)胞混懸培養(yǎng)物的極少數(shù)情況以外，原生質(zhì)體能夠從中衍生出來 的葉肉細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)（G0)，并且只有當(dāng)采用一個(gè)適當(dāng)?shù)募に仄胶庥|發(fā)原生質(zhì)體時(shí)，它 們將重新進(jìn)入細(xì)胞周期并積極地開始流動(dòng)。一個(gè)靜止原生質(zhì)體經(jīng)過一輪細(xì)胞周期所需的時(shí) 間在系統(tǒng)之間有很大不同，并且能夠從幾個(gè)小時(shí)到幾天。此外，一旦用于生成原生質(zhì)體的酶 混合物被清洗掉，原生質(zhì)體就開始再形成其細(xì)胞壁，如果不采取預(yù)防措施來減緩或阻止細(xì) 胞壁再形成，這將降低甚至完全阻止外來分子的引入。因此，當(dāng)要遞送感興趣的分子時(shí)原生 質(zhì)體不能置之不理直至它們達(dá)到適當(dāng)?shù)碾A段，必須積極地預(yù)防細(xì)胞壁的再形成同時(shí)應(yīng)該保 留原生質(zhì)體的流動(dòng)能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明已經(jīng)著手克服本領(lǐng)域的這些缺點(diǎn)并且已經(jīng)發(fā)明一種方法，在所述方法中能 夠更加有效地并且以更加可控的方式控制和轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體和細(xì)胞周期。
[0015] 本發(fā)明人目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)轉(zhuǎn)染步驟的組合允許原生質(zhì)體中幾個(gè)生物學(xué)過程的 詳細(xì)控制。兩個(gè)轉(zhuǎn)染步驟的組合可以與細(xì)胞壁抑制劑的使用，和/或細(xì)胞時(shí)相（phase)同 步步驟組合。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在第一轉(zhuǎn)染步驟中與某些通路相互作用和/或?qū)е码p鏈DNA 斷裂并且在第二轉(zhuǎn)染步驟中采用外來分子進(jìn)行轉(zhuǎn)染的各種組合物的引入允許轉(zhuǎn)染過程改 進(jìn)的效率和控制。本發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，通過向原生質(zhì)體中加入一種或多種非酶化學(xué)化合 物，所述化學(xué)化合物干擾細(xì)胞壁的形成如通過抑制纖維素合成酶、纖維素沉積或捕捉新興 的纖維素微纖絲，通過外來分子的遞送在時(shí)間上更加接近細(xì)胞周期中所需時(shí)相的可能性， 外來分子引入的時(shí)機(jī)和效率能夠被增強(qiáng)和優(yōu)化。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過在特定的細(xì)胞時(shí)相 同步細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)增加的轉(zhuǎn)染。
[0016] 從更廣泛的方面講，錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)和/或NHEJ通路和/或DNA雙鏈斷裂的引入的 (瞬時(shí)）抑制以及（ii)采用感興趣的外來分子如致突變的寡核苷酸的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)染，任 選地與原生質(zhì)體系統(tǒng)中細(xì)胞壁再形成的瞬時(shí)抑制和/或細(xì)胞周期時(shí)相的同步結(jié)合是非常 有價(jià)值的，當(dāng)細(xì)胞系統(tǒng)必須在細(xì)胞周期的特殊階段被轉(zhuǎn)染時(shí)，當(dāng)細(xì)胞在特定生物/生化過 程中變得熟練時(shí)，所述過程在時(shí)間上遠(yuǎn)離原生質(zhì)體分離的時(shí)間點(diǎn)。此外，原生質(zhì)體系統(tǒng)中細(xì) 胞壁再形成的瞬時(shí)抑制允許瞬時(shí)表達(dá)的質(zhì)粒的順序引入，其組合作用導(dǎo)致所需的結(jié)果。例 如，如果某時(shí)引入ZFN構(gòu)建體，例如，在引入供體構(gòu)建體之前的4、6、12、18或24小時(shí)，基因 靶向是更有效的。這允許ZFNs被表達(dá)并且誘導(dǎo)對(duì)于適當(dāng)?shù)幕虬邢蚴录匦璧腄SBs的 發(fā)生。
[0017] 發(fā)明詳述
[0018] 在第一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于向植物細(xì)胞原生質(zhì)體中引入一種或多種感興趣 的分子的方法，所述方法包含下列步驟
[0019] -通過酶降解和/或從植物細(xì)胞中移除細(xì)胞壁來提供植物細(xì)胞原生質(zhì)體；
[0020] -進(jìn)行植物細(xì)胞原生質(zhì)體的第一轉(zhuǎn)染，所述轉(zhuǎn)染采用
[0021] i.能夠改變選自錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)、非同源性末端連接（non-homologousend joining)的一種或多種通路的調(diào)節(jié)的第一組合物；和/或
[0022] ii.能夠誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的第二組合物
[0023] -采用一種或多種感興趣的分子進(jìn)行植物細(xì)胞原生質(zhì)體的第二轉(zhuǎn)染；
[0024]-允許細(xì)胞壁形成；
[0025] 其中第二轉(zhuǎn)染在第一轉(zhuǎn)染之后進(jìn)行。
[0026] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解的是，術(shù)語"和/或"在本發(fā)明的范圍中意味著可以進(jìn)行 采用第一組合物的轉(zhuǎn)染、或者采用第二組合物的轉(zhuǎn)染、或者采用二者的轉(zhuǎn)染。所以根據(jù)本發(fā) 明的第一轉(zhuǎn)染，及其實(shí)施方案可以包含第一組合物或第二組合物或二者。
[0027] 在方法的第一步中，從植物細(xì)胞中提供原生質(zhì)體。使用用于產(chǎn)生植物細(xì)胞原生 質(zhì)體的常用程序（例如，使用軟化霉素）