一種檢測(cè)樣品中活菌體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品、環(huán)境以及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及一種檢測(cè)樣品中活菌體的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 致病菌（Pathogenicbacteria)能引起疾病的微生物稱(chēng)為病原微生物或致病菌。 病原微生物包括細(xì)菌、病毒、螺旋體、立克次氏體、衣原體、支原體、真菌及放線菌等。一般所 說(shuō)的致病菌指的是病原微生物中的細(xì)菌。細(xì)菌的致病性與其毒力、侵入數(shù)量及侵入門(mén)戶(hù)有 關(guān)。雖然絕大多數(shù)細(xì)菌是無(wú)害甚至有益的，但是相當(dāng)大一部分可以致病。條件致病菌只在 特定條件下致病，如有傷口可以允許細(xì)菌進(jìn)入血液，或者免疫力降低時(shí)。例如，金黃色葡萄 球菌和鏈球菌也是正常菌群，?？梢源嬖谟隗w表皮膚，鼻腔而不引起疾病，但可以潛在引起 皮膚感染，如肺炎（pneumonia),腦膜炎（meningitis)和敗血癥（sepsis)等。
[0003]目前，檢測(cè)致病菌的方法只能檢測(cè)樣品中的致病菌的總體數(shù)量，而不能區(qū)分樣品 中的活菌體和死菌體的數(shù)量分別為多少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了將待測(cè)樣品中的死菌體和活菌體區(qū)別開(kāi)來(lái)，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中活 菌體的方法，該方法包括：（1)將能夠特異地與活菌體結(jié)合的抗體偶聯(lián)在磁球上，得到免疫 磁球；所述能夠特異地與活菌體結(jié)合的抗體不能與死菌體結(jié)合；（2)將免疫磁球與液體形 式的待測(cè)樣品進(jìn)行混合，得到混合后的物料；混合的條件使得當(dāng)待測(cè)樣品中存在活菌體時(shí)， 免疫磁球能夠特異性地吸附活菌體；（3)將所述混合后的物料置于分選磁場(chǎng)中以固定免疫 磁球，并洗脫未吸附在免疫磁球上的物質(zhì)，得到洗脫后的免疫磁球；（4)將吸附在免疫磁球 上的物質(zhì)進(jìn)行提取DNA的操作，得到模板樣品；（5)使用針對(duì)所述活菌體的特異性引物對(duì)模 板樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的目的片段的含量判斷待測(cè)樣品中的活菌體 的含量
[0005] 通過(guò)上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠有效地將待測(cè)樣品中的死菌體和活菌體區(qū)別開(kāi) 來(lái)。
[0006] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說(shuō)明。
【具體實(shí)施方式】
[0007] 以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0008] 在本發(fā)明中，在未作相反說(shuō)明的情況下，使用的術(shù)語(yǔ)"免疫磁球"是指通過(guò)偶聯(lián)反 應(yīng)將抗體結(jié)合到磁性微球的表面上，形成的免疫磁性微球。術(shù)語(yǔ)"PCR"是指聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)。術(shù)語(yǔ)"引物"包括至少一個(gè)上游引物和至少一個(gè)下游引物。本發(fā)明中使用的液體體積 均為20°C下的數(shù)值。
[0009] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中活菌體的方法，該方法包括：（1)將能夠特異地與 活菌體結(jié)合的抗體偶聯(lián)在磁球上，得到免疫磁球；所述能夠特異地與活菌體結(jié)合的抗體不 能與死菌體結(jié)合；（2)將免疫磁球與液體形式的待測(cè)樣品進(jìn)行混合，得到混合后的物料；混 合的條件使得當(dāng)待測(cè)樣品中存在活菌體時(shí)，免疫磁球能夠特異性地吸附活菌體；（3)將所 述混合后的物料置于分選磁場(chǎng)中以固定免疫磁球，并洗脫未吸附在免疫磁球上的物質(zhì)，得 到洗脫后的免疫磁球；（4)將吸附在免疫磁球上的物質(zhì)進(jìn)行提取DNA的操作，得到模板樣 品；（5)使用針對(duì)所述活菌體的特異性引物對(duì)模板樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 中的目的片段的含量判斷待測(cè)樣品中的活菌體的含量。
[0010] 其中，獲得能夠特異地與活菌體結(jié)合的抗體的方式可以為：將已通過(guò)交叉反應(yīng)檢 測(cè)而確定能特異地與菌體結(jié)合的抗體，進(jìn)行活菌體中和反應(yīng)檢測(cè)，去除能與死菌體結(jié)合的 抗體，剩余的抗體為不能與死菌體結(jié)合但能夠特異地與活菌體結(jié)合的抗體。
[0011] 其中，將抗體偶聯(lián)在磁球上的方法可以按照本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行，例如按照文 獻(xiàn)(劉輝榮等，簡(jiǎn)便高效分離細(xì)胞新型免疫磁珠制備，中國(guó)公共衛(wèi)生，2008, 11:1349-1351) 中的方法進(jìn)行。
[0012] 其中，混合的條件可以包括：溫度為35-37°C，時(shí)間為180min;混合可以在磷酸緩 沖液中進(jìn)行，所述磷酸緩沖液含有〇? 144-0. 162mol/L的磷酸氫二鈉和0? 038-0. 056mol/L 的磷酸二氫鈉。
[0013] 其中，作為本發(fā)明特別優(yōu)選的一種實(shí)施方式，所述活菌體為大腸桿菌0157 (Escherichiacoli，0157:H7)，所述能夠特異地與活菌體結(jié)合的抗體為編號(hào)為01-95-90的 KPL多克隆抗體，該抗體可以從KPL公司商購(gòu)得到，商品號(hào)（Cat. #)為01-95-90。
[0014] 其中，作為本發(fā)明特別優(yōu)選的一種實(shí)施方式，所述活菌體為沙門(mén)氏菌（鼠傷寒沙門(mén) 氏菌（Salmonellatyphimurium)，所述能夠特異地與活菌體結(jié)合的抗體為編號(hào)為01-95-99 的KPL多克隆抗體，該抗體可以從KPL公司商購(gòu)得到，商品號(hào)（Cat. #)為01-95-99。
[0015] 其中，作為本發(fā)明特別優(yōu)選的一種實(shí)施方式，所述活菌體為志賀氏菌(痢疾志賀氏 菌，Shigelladysenteriae)，所述能夠特異地與活菌體結(jié)合的抗體為編號(hào)為B65901R的Meridian多克隆抗體，該抗體可以從Meridian公司商購(gòu)得到，商品號(hào)（Cat. #)為B65901R。 [0016] 其中，作為本發(fā)明特別優(yōu)選的一種實(shí)施方式，所述活菌體為金黃色葡萄球菌 (Staphyloccocusaureus),所述能夠特異地與活菌體結(jié)合的抗體為編號(hào)為01-90-05的KPL多克隆抗體，該抗體可以從KPL公司商購(gòu)得到，商品號(hào)（Cat. #)為01-90-05。
[0017] 其中，優(yōu)選情況下，相對(duì)于每毫克的磁球，所述抗體的用量為0. 〇5-2mg。
[0018] 其中，優(yōu)選情況下，相對(duì)于每毫升的液體形式的待測(cè)樣品，以磁球的重量計(jì)，所述 免疫磁球的用量為10-25yg。
[0019] 其中，步驟（3)中，洗脫所用的液體為磷酸緩沖液，所述磷酸緩沖液含有 0? 144-0. 162mol/L的磷酸氫二鈉和 0? 038-0. 056mol/L的磷酸二氫鈉。
[0020] 其中，作為本發(fā)明特別優(yōu)選的一種實(shí)施方式，當(dāng)所述活菌體為大腸桿菌 0157(Escherichiacoli，0157:H7)時(shí)，PCR擴(kuò)增所用的引物包括如SEQIDNO: 1 所 示的正向引物（5, -AATAGCCTGGTAGTCTTGT-3'）和如SEQIDN0:2所示的反向引物 (5' -GTTTGATAAATCGTGGTCT-3'）；或者，當(dāng)所述活菌體為沙門(mén)氏菌時(shí)，PCR擴(kuò)增所用的引物 包括如SEQIDN0:3 所示的正向引物（5'-TCCTCCGCTCTGTCTACTTA-3，）和如SEQIDN0:4 所示的反向引物（5 ' -ACCGAAATATTCATTGACGTT-3 '）;或者，當(dāng)所述活菌體為志賀氏菌時(shí)，PCR擴(kuò)增所用的引物包括如SEQIDN0:5所示的正向引物（5, -CATGGCTGGAAAAACTCAGTGC-3'） 和如SEQIDNO: 6所示的反向引物（5 ' -CTCATACTTCTGCTCTTCTGCC-3 '）；或者，當(dāng)所述 活菌體為金黃色葡萄球菌時(shí)，PCR擴(kuò)增所用的引物包括如SEQIDN0:7所示的正向引物 (5'-GCGAITGATGGTGATACGGIT-3'）和如SEQIDN0:8 所示的反向引物（5'-AGCCAAGCCTTGAC GAACTAAAGC-3,）。
[0021] 其中，優(yōu)選情況下，所述磁球?yàn)楸砻嫘揎椨邪被螋然某槾判訤e304聚苯乙烯 復(fù)合微球。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，待測(cè)樣品可以為食品和/或藥品。具體地，可以按照國(guó) 家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 1-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則》中的方法取得待測(cè)樣 品。
[0023] 以下將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中，所述磷酸緩沖液為含 有0. 153m