甲亢易感性檢測方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及甲亢易感性檢測方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]Graves'病（Graves'disease,⑶），又稱毒性彌漫性甲狀腺腫伴甲允，通常稱為甲 亢，是一種甲狀腺激素（TH)分泌增多的、遺傳與環(huán)境共同起作用導(dǎo)致的器官特異性自身免 疫性疾病，是甲狀腺功能亢進(jìn)的最常見病因。甲亢臨床上的典型特征包括彌漫性甲狀腺腫、 甲狀腺功能亢進(jìn)的系列表現(xiàn)、眼癥以及脛前黏液水腫和指端粗厚。甲亢在臨床上目前為免 疫內(nèi)分泌主要疾病之一，甲亢所引起的心衰、甲狀腺危象的發(fā)生，常危及患者生命，致疾病 預(yù)后不良。最近的調(diào)查顯示中國人群的發(fā)病率為〇. 25~1. 09%,估計患者約有1300萬。亞 洲人群的發(fā)病率較歐美和非洲人群發(fā)病率略
[0003] 同胞對研究顯示，同卵雙胞胎患甲允的一致率達(dá)36%,異卵雙胞胎患病 率為3%，甲亢發(fā)病的所有影響因素中遺傳的比重占79%〔Brix，T.H.，Kyvik，K. 0. ,Christensen,K. &Hegedus,L.Evidenceforamajorroleofheredityin Graves'disease:apopulation-basedstudyoftwoDanishtwincohorts.JClin EndocrinolMetab86, 930-4(2001)〕。遺傳因素在甲亢的發(fā)病機制中具有重要的作用。
[0004] 甲亢的發(fā)病率存在著明顯的男女差異。好發(fā)于生育年齡的女性，女性發(fā)病率大約 是男性的5-10倍。在Turner綜合征患者中甲允的發(fā)病率很高，而Turner綜合征是由于X 染色體缺失或有其他異常導(dǎo)致的。研究也發(fā)現(xiàn)甲亢患者體內(nèi)X染色體失活偏移發(fā)生率顯著 高于同年齡段的健康個體。這些現(xiàn)象一致提示X染色對甲亢發(fā)病有重要的影響。
[0005] 近年來，單核苷酸變異（SNP)概念在多基因疾病研究中的廣泛運用，同時，高通 量、低成本的SNP檢測手段的不斷出現(xiàn)也為SNP大規(guī)模快速分型提供了可能。這為在分子 水平上研究甲亢的發(fā)生和發(fā)展的機制開辟了全新的思路和手段。SNP的存在與否以及等位 基因頻率存在人種及地域的差異，這就提示多基因疾病遺傳異質(zhì)性的存在，即同一疾病或 性狀在不同的人群中可能是不同的遺傳因素造成的。另外，不同人群中SNP類型和頻率存 在的這種差異也與不同人群對藥物及環(huán)境因素的反應(yīng)性不同密切相關(guān)。
[0006] 甲亢作為一種遺傳因素起較大作用的疾病，尋找易感基因基因進(jìn)而闡明其遺傳 機制已經(jīng)成為目前研究的熱點。雖然已有許多關(guān)于遺傳變異與甲亢的研究，但沒有證實 GPR174基因與甲亢相關(guān)性的報道，更沒有證實本發(fā)明所述的GPR174基因SNP與甲亢相關(guān)性 的報道。
[0007] 綜上所述，為了早期預(yù)防和診斷甲亢，本領(lǐng)域迫切需要尋找甲亢易感基因，并開發(fā) 用于甲亢疾病預(yù)警的方法和試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明人運用Plink軟件對X染色體的數(shù)據(jù)同常染色一樣進(jìn)行常規(guī)的Cochran Armitage趨勢檢驗，沒有發(fā)現(xiàn)X染色體上的易感基因。鑒于Plink軟件常規(guī)Cochran Armitage趨勢檢驗的方法對X染色體分析的缺陷，本發(fā)明人進(jìn)一步用另外的兩種方法(男 女分層分析和Clayton的方法)對X染色體進(jìn)行分析。兩種關(guān)聯(lián)分析的方法都顯示一組存在 著強LD關(guān)系的SNPs與⑶相關(guān)。這些關(guān)聯(lián)的SNPs位于Xq21. 1區(qū)域，分布在GPR174基因及 其周圍區(qū)域。P值最低的SNP是距離GPR174基因約155-kb的rs5912838(P1()gisti。_essim= 4. 60Xl(T8;PsnpMataix=L36Xl〇-9;OR=L80, 95%CI1. 48-2. 18)。推定填補分析并沒有在Xq21. 1 區(qū)域發(fā)現(xiàn)P值更低的SNPs。在這些關(guān)聯(lián)的SNPs當(dāng)中，rs3827440是一個導(dǎo)致GPR174發(fā)生 非同義突變的SNP，它與P值最低的rs3827440之間存在著強的LD關(guān)系。雖然rs3827440 不是這一區(qū)域P值最低的SNP，但是它是非常值得研究的功能變異。
[0009] 在驗證階段的4, 564例患者和3, 968例性別匹配的對照中，對rs3827440進(jìn)行分 型。統(tǒng)計結(jié)果驗證了最初的關(guān)聯(lián)，并且合并分析的P值達(dá)到了全基因組關(guān)聯(lián)研究的顯著性 水平（combinedPlogisticregression=5. 53X1CT21;combinedPsnpMatrix=4. 26X1CT22; 0R=1. 69, 95%C IL53-L86;表 3-6)。rs3827440 的OR值為 1.69 (95%C11.53-1.86)，在本發(fā)明的研究樣 本中僅低于HLA區(qū)域的rs4947296。提示在中國人群中GPR174是一個重要的易感基因。
[0010]RS3827440是GPR174基因編碼區(qū)的第519位C-T變異，造成第162位氨基酸由 脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸（P162S)。本發(fā)明的重測序結(jié)果顯示5'非翻譯區(qū)（5'UTR)區(qū)域的兩個 SNPs(rs3810711與rs3810712)與rs3827440是完全連鎖不平衡關(guān)系。RT-PCR結(jié)果顯示 rs3827440的基因型與外周血GPR174的表達(dá)量相關(guān)。無論男性群體還是女性群體，TT或T 基因型都與GPR174的高表達(dá)相關(guān)(分別為P=0. 009和P=0. 029)。在男女混合人群中，攜帶 TT或T的群體GPR174的表達(dá)量顯著高于攜帶CC或C的群體（P=0.002)。這些結(jié)果提示， rs3827440或者其他兩個與之連鎖的5'UTR區(qū)域SNPs(rs3810711與rs3810712)單獨或 者共同影響了GPR174基因的表達(dá)量，從而影響了GD的遺傳易感性。
[0011] 因此，本發(fā)明的目的就是提供一種輔助診斷（尤其是早期診斷）甲亢的方法及檢 測試劑盒。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療甲亢的方法。
[0013] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對個體的甲亢易感性進(jìn)行診斷的方法，它包括 步驟：
[0014] 檢測該個體的GPR174基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的GPR174基因、轉(zhuǎn)錄本 和/或蛋白相比較，
[0015] 存在差異就表明該個體患甲亢的可能性高于正常人群。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法中檢測的是GPR174的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常 GPR174核苷酸序列比較差異。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性：
[0018] 367 位C-T;
[0019] 其中，核苷酸位置編號基于SEQID N0:1。
[0020] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測樣品是否存在G蛋白偶聯(lián)受體174 (GPR174)的單核苷酸多態(tài)變異的方法，包括步驟：
[0021] (a)用GPR174基因特異性引物擴增樣品的GPR174基因，得到擴增產(chǎn)物；
[0022]和
[0023] (b)檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性：
[0024] 367 位C-T;
[0025] 其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO: 1。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的基因特異性引物具有SEQID N0:2和3的序列。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的擴增產(chǎn)物的長度為100_2000bp、優(yōu)選為150_1500bp、更 佳地為200-1000bp，且含有SEQIDNO: 1中第367位。
[0028] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于輔助診斷甲亢或檢測甲亢易感性甲亢的試 劑盒，它包括特異性擴增GPR174基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，更佳地，所述的引物擴增出長度為 100-2000bp，且含有SEQIDNO: 1中第367位的擴增產(chǎn)物。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有選自下組的試劑：
[0030] (a)與SEQIDNO: 1中第367位的突變結(jié)合的探針；
[0031] (b)識別SEQIDNO: 1中第367位的突變的限制性內(nèi)切酶。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性：
[0033] 367 位C-T;
[0034] 其中，核苷酸位置編號基于SEQID N0:1。
[0035] 本發(fā)明還涉及能特異性擴增GPR174基因或轉(zhuǎn)錄本、且所擴增的產(chǎn)物含有SEQID NO:1的第367位的引物在制備用于輔助診斷甲亢或檢測甲亢易感性的試劑盒中的應(yīng)用。
[0036] 在一個【具體實施方式】中，所述引物擴增出的產(chǎn)物長度為100_2000bp，優(yōu)選為 150-1500bp，更佳地為 200-1000bp，更佳為 200-800bp。
[0037] 在一個【具體實施方式】中，所述試劑盒還含有：
[0038] (a)與SEQIDNO: 1中第367位的突變結(jié)合的探針；
[0039] (b)識別SEQIDNO: 1中第367位的突變的限制性內(nèi)切酶。
[0040] 在一個【具體實施方式】中，所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性：
[0041] 367 位C-T;
[0042] 其中，核苷酸位置編號基于SEQID N0:1。
【具體實施方式】
[0043] 本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，對遍布X染色體上大量SNPs進(jìn)行了測定和分 析。首次發(fā)現(xiàn)和證明了GPR174的基因組序列與甲亢密切相關(guān)，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在 GPR174的SEQIDNO: 1中第367位的SNP(367位C-T)(記為RS3827440)在對照組和病 例組中的分布存在顯著性差異（P〈〇. 05)，因此可作為輔助性檢測甲亢（或其易感性）的特 異性SNP。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0044]G蛋白偶聯(lián)受體 174(Gprotein-coupledreceptorl74,GPR174)基因位于染色 體Xq21. 1區(qū)域，由一個編碼333個氨基酸的外顯子組成，這個基因?qū)儆贕PCR超家族，被歸 為GPCR1類基因家族。GPCR超家族是跨膜蛋白，共同特點是有7個a-螺旋的跨膜區(qū)，在細(xì) 胞信號傳導(dǎo)中起重要作用。至今已發(fā)現(xiàn)超過50%的藥物的作用靶點都是GPCRs。最近，有研 究發(fā)現(xiàn)LysoPS是GPR174的配體。在體內(nèi)，LysoPS是由免疫系統(tǒng)分泌，作為一個脂類介質(zhì) 調(diào)控體內(nèi)免疫進(jìn)程。LysoPS與GPR174結(jié)合后可以刺激細(xì)胞外cAMP濃度的增加，并且這種 刺激作用是劑量依賴的。研究也發(fā)現(xiàn)，引起cAMP水平增高或者cAMP的類似物都會阻止體 內(nèi)Thl類細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但是Th2因子的產(chǎn)生不受影響，甚至提高。通常認(rèn)為⑶是一種 以Th2類反應(yīng)為主導(dǎo)的疾病。因此，cAMP水平增高導(dǎo)致的Th2類反應(yīng)占主導(dǎo)有可能參與了 ⑶的病理過程。
[0045] 我們的研究顯示易感等位基因?qū)е翯PR174基因表達(dá)水平的提高，而GPR174基因 表達(dá)水平的提高有可能導(dǎo)致胞外cAMP濃度的增高。我們的表達(dá)譜結(jié)果分析顯示GPR174基 因廣泛的表達(dá)于免疫相關(guān)的組織，并且在甲狀腺中也有一定量的表達(dá)。這種表達(dá)模式提示 GPR174基因可能參與免疫過程，并且與甲狀腺的結(jié)構(gòu)或者功能有一定的聯(lián)系，有可能在GD 的發(fā)病過程中起重要作用。
[0046] 本發(fā)明人通過對分布于整條X染色體的SNPs在中國人群中進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn) GPR174基因上的rs3827440(SEQIDN0:1中367位C-T)與甲亢的易感性相關(guān)。rs3827440 是GPR174基因編碼區(qū)的第519位C-T變異，造成第162位氨基酸由脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸 (P162S)。另外對GPR174基因中的整個外顯子區(qū)域進(jìn)行了測序，發(fā)現(xiàn)了許多頻率較低的SNP 也與甲亢易感性相關(guān)。以rs3827440對甲亢的遺傳貢獻(xiàn)率最大。
[0047] 具體而言，本發(fā)明揭示了GPR17