與白菜黃色種皮基因Brsc-ye連鎖的SSR分子標記引物及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蔬菜育種及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及與白菜黃色種皮基因Brsc-ye 連鎖的SSR分子標記引物的開發(fā)及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 白菜（BrassicarapaL.)屬十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種，是起源于我國的主 要蔬菜作物之一，也是世界三大油菜之一，與人們的日常生活密切相關(guān)，近年來，隨著人們 生活水平的提高，人們對油料品質(zhì)的要求日益高漲。因此，黃色種皮白菜育種受到越來越多 國內(nèi)外學(xué)者，育種家的重視。
[0003] 研宄表明黃色種皮的油菜籽種皮薄，所以含油量高，不僅如此，黃色種皮油菜籽生 產(chǎn)的油粗纖維含量較低，蛋白質(zhì)含量較高，受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。但是，白菜種皮顏色需 要開花結(jié)實且種子成熟后才能表現(xiàn)出，而且需要在田間逐株觀察，操作起來費時費力，極大 的延緩了育種進程。因此為了加快黃籽白菜的育種速度，利用現(xiàn)代的分子生物技術(shù)，進行分 子標記輔助育種十分必要。
[0004] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，多種基于DNA多態(tài)性的分子技術(shù)應(yīng)運而生，并 廣泛應(yīng)用于遺傳育種研宄的各個領(lǐng)域。簡單序列重復(fù)（simplesequencerepeats，SSR)，又 稱為微衛(wèi)星DNA(microsate11ite，DNA)，是一類由1-6個核苷酸串聯(lián)重復(fù)組成的DNA序列如 (CA)n，（ATG)n，（TAGG)n等重復(fù)，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，由于重復(fù) 次數(shù)的不同和重復(fù)程度的不完全造成了每個位點的多態(tài)性，包括SSR標記和EST-SSR標記 兩種類型。其中，SSR標記具有共顯性、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、易于檢測等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用 于植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和分子標記輔助育種等研宄領(lǐng)域（Tautz andSchl6tterer，1994;Powelletal.，1996)0
[0005] 因此，基于以上SSR標記的優(yōu)點，申請人利用白菜的測序結(jié)果，開發(fā)并成功篩選出 與白菜種皮顏色基因Brsc-ye緊密連鎖的分子標記，并構(gòu)建了Brsc-ye基因的分子遺傳圖 譜，為克隆該基因及利用該分子標記進行黃籽油菜、白菜分子輔助育種，加快育種進程奠定 了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于，提供一種與白菜種皮顏色基因Brsc-ye緊密連鎖的SSR分子 標記引物，應(yīng)用該SSR分子標記引物，通過PCR方法，在苗期即可鑒定區(qū)分黃籽白菜和棕籽 白采，從而淘汰非目標植株，大大提尚選擇的效率。
[0007] 為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案：
[0008] 與白菜種皮顏色基因Brsc-ye連鎖的SSR分子標記引物，包括已鑒定出的7對SSR 引物對中的一對，即可將黃色種皮與棕色種皮白菜區(qū)分開，同時使用兩個標記能提高選擇 的準確性。7對SSR引物對的脫氧核糖核苷酸引物序列如下：
[0009]引物對SSR309:
[0010]上游引物（F):5 ' -ACACTTTCTTCCTCCTCCCTCTCT- 3 ';
[0011]下游引物（R) :5 ' -CTCTCAACACTCCTCTCGHTTCC- 3 ';
[0012] 引物對SSR328:
[0013] 上游引物（F):5 ' -GAAGCCTGTTTGAACATTAC- 3 ';
[0014] 下游引物（R) :5 ^ -ATCTCCATTAGTTACTACGC- 3 ';
[0015]引物對SSR282:
[0016] 上游引物（F):5 ' -ATAACAACACTAGGCGACAG- 3 '
[0017] 下游引物（R) :5 ' -CTCTGCTAACACTTCCCTCT- 3 '
[0018]引物對SSR289:
[0019] 上游引物（F):5 ' -GCTGGTTAGGTGGTGTTGGT- 3 '
[0020] 下游引物（R) :5 ' -GTGGTGCITTGTCTTCGTCA- 3 '
[0021] 引物對SSR298:
[0022] 上游引物（F):5 ' -GCTCCAGGTGTTACCATATT- 3 '
[0023] 下游引物（R) :5 ' -TATCACCCAAAGCAAAGGAC- 3 '
[0024]引物對SSR340:
[0025] 上游引物（F):5 ' -AACCTAATTTCGTGTTCATG- 3 '
[0026] 下游引物（R) :5 ' -AAAGACAGTACGCACAGACA- 3 '
[0027]引物對SSR344:
[0028] 上游引物（F):5 ' -TGTTGTGGTTCTGAAATGGA- 3 '
[0029] 下游引物（R) :5 ' -TGAAGATGGTGAATGAAGCC- 3 '
[0030] 采用上述與白菜黃色種皮基因Brsc-ye緊密連鎖的SSR分子標記引物，通過DNA 擴增，在苗期即可鑒定區(qū)分黃色種皮和棕色種皮白菜，從而淘汰非目標植株，大大提高選擇 的效率。同時白菜黃色種皮基因Brsc-ye分子遺傳圖譜的構(gòu)建可加快克隆該基因。
[0031] 所述的白菜黃色性狀輔助選擇的方法是：PCR擴增黃籽白菜基因組DNA的多態(tài)性 片段，引物SSR309和SSR328分別產(chǎn)生大小約為252bp和109bp的產(chǎn)物，這兩個SSR標記分 別位于Brsc-ye的兩側(cè)，與Brsc-ye的遺傳距離分別為0. 17cM和0. 29cM。
[0032] 本發(fā)明首次獲得了與白菜黃色種皮基因Brsc-ye最為緊密連鎖的分子標記引物， 具有檢測方便，擴增穩(wěn)定，重復(fù)性和準確率高等優(yōu)點。其具體有益效果表現(xiàn)在：
[0033] (1)獲得了在第6連鎖群（A06)上白菜黃色種皮基因Brsc-ye的分子遺傳圖譜， 且首次獲得與Brsc-ye基因緊密連鎖的分子標記SSR309和SSR328,可在黃籽白菜分子標記 輔助育種及Brsc-ye基因克隆中發(fā)揮重要的作用。
[0034] (2)獲得了與Brsc-ye緊密連鎖的分子標記，并構(gòu)建了其高密度遺傳圖譜。其中 SSR328與Brsc-ye連鎖緊密，其遺傳距離為0. 29cM，SSR309與Brsc-ye連鎖最為緊密，其 遺傳距離為〇. 17cM，這兩個標記能夠幫助該基因向推廣品種中轉(zhuǎn)移以及與其他抗病、抗逆 基因的聚合。
[0035] (3)鑒定方便。這2個標記均為共顯性標記，具有擴增穩(wěn)定、檢測方便、快速等優(yōu) 點。用這2個分子標記檢測Brsc-ye基因，可以確定Brsc-ye的存在與否及存在的狀態(tài)，進 而快速篩選攜有Brsc-ye基因的植株，并用于黃籽白菜品種的選育。同時利用分子標記進 行檢測時還可以避免環(huán)境對品種的影響，提高選擇的準確性。
[0036] (4)提高黃籽白菜的選擇效率。在傳統(tǒng)的黃籽白菜鑒定過程中，必須等到白菜開花 結(jié)實且種子成熟后才能對種皮顏色性狀進行觀察統(tǒng)計，因此黃籽白菜的選育不僅費時，而 且難度大，成本高。用本發(fā)明的分子標記引物，通過檢查與白菜黃色種皮基因Brsc-ye緊密 連鎖的分子標記，可將表型鑒定的工作大大減少，在苗期即可區(qū)分黃籽和棕籽白菜，從而淘 汰非目標植株，因此，利用本發(fā)明的與Brsc-ye基因緊密連鎖的分子標記，不僅節(jié)約成本， 而且大大的提高了育種效率，加快了育種進程。
[0037] (5)可用于克隆白菜黃籽基因的研宄。圖位克隆白菜黃籽基因Brsc-ye的前提在 于獲得與Brsc-ye緊密連鎖的分子標記。SSR309和SSR328在所有已知的分子標記中與 Brsc-ye連鎖最為緊密，為克隆該基因提供基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0038] 圖1是白菜黃籽基因Brsc-ye的遺傳連鎖圖，右側(cè)為遺傳連鎖圖的標記，左側(cè)數(shù)據(jù) 為標記間的遺傳距離（cM)。
[0039] 圖2是SSR309在黃籽和棕籽親本及匕代單株中的擴增結(jié)果；泳道信息：（從左到 右）M，50bpDNAladder;BP是棕籽親本；YP是黃籽親本，7個純合棕籽單株；7個雜合棕籽 單株；7個純合黃籽單株。
[0040] 圖3 (a)棕籽材料92S105和（b)黃籽材料09Q5的種子。
[0041] 以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
【具體實施方式】
[0042] 以下實施例中的實驗方法均為常規(guī)方法，所涉及的實驗試劑均為常規(guī)生化試劑。
[0043] 本發(fā)明的與白菜黃籽基因Brsc-ye緊密連鎖的SSR分子標記引物是通過以下步驟 獲得的：
[0044] (1)群體材料準備
[0045] 以棕籽白菜"92S105"（西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）2011 (3) 11: 146-151)為母本，黃籽白菜"09Q5"（秦白6號大白菜的親本之一，陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999(3)， 5-6)為父本雜交產(chǎn)生的F1群體，然后通過單株自交獲得其F2群體。
[0046] (2)白菜單株基因組總DNA的提取
[0047]A、取0. 2g去掉主脈的新鮮嫩葉片，塞入裝有鋼珠（鋼珠需要由質(zhì)量分數(shù)為75%的 酒精清洗過）的2mL的離心管中，放入液氮中速凍，利用組織研磨儀磨成粉末；
[0048] B、向離心管中加700 y 1經(jīng)65°C預(yù)熱的CTAB提取液（CTAB :2%，Tris-HCl (pH = 8.0) :100mmol/L，EDTA:20mmol/L，NaCl :1.4mol/L)，再加入10uL的0-疏基乙醇，迅速混 勻；
[0049]C、隨后將離心管放入65°C烘箱中，中間每間隔5-10min分鐘搖一次，溫浴45min;
[0050]D、取出離心管，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1)的混合物，搖勻15min 后，常溫下l〇〇〇〇r/min離心lOmin;
[0051]E、將上層液相（約700y1)轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入等體積的氯仿和異戊醇混 合溶液（氯仿：異戊醇=24 :1)，輕輕搖勾10min，常溫下10000r/min離心10min;
[0052]F、取上清（約500yl)，加入2倍體積經(jīng)預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻使DNA抱 團，-20°C條件下沉淀30min，4°C條件下8000r/min離心5min;
[0053]G、棄上清，加入500y1質(zhì)量百分數(shù)為75%的乙醇洗滌沉淀2次后，沉淀物室溫晾 干；
[0054]H、加入500y1的無菌蒸餾水溶解DNA，加入0? 29y1的RNaseA(10yg/y1)，混 勻后稍離心，37°C保溫30min;
[0055]I、加入3mol/L的NaAc溶液50yL和2倍體積經(jīng)預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻使DNA 抱團，-20°C條件下沉淀30min;
[0056] ]\在4<€條件下，800〇1'/111；[11離心5111；[11，棄上清，加入質(zhì)量百分數(shù)為75%的乙醇清 洗沉淀1~2次后，沉淀物室溫晾干，加入400y1~500y1的滅菌ddH20溶解使用，或加 入質(zhì)量百分數(shù)為75%的乙醇-20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0057] (3)SSR序列的獲得
[0058] 根據(jù)http://brassicadb.org/brad/index中公布的已知引物，共選取白菜10對 染色體上已知的引物120對，利用親本材料對120對引物進行篩選，共篩選出30對差異引 物，然后隨機選擇棕籽材料和黃籽材料各7株，對這30對引物進行再次篩選，發(fā)現(xiàn)1對差異 引物A67,隨后繼續(xù)選取A67引物兩側(cè)已知引物，發(fā)現(xiàn)了另一對差異引物A0611。進一步沿 A0611到Brsc-ye方向設(shè)計SSR引物。利用SSRHunter軟件對該區(qū)間序列內(nèi)的SSR位點進 行檢索，檢索標準為：含二、三、四、五和六核苷酸類型的SSR基序（motif)的最小重復(fù)數(shù)分 別為5,4,3,3和3次。將檢索得到的含SSR位點的序列在蕓薹屬基因組網(wǎng)站（http://www. brassica.bbsrc.ac.uk/)進行同源性比對，SSR序列選取條件為比對相似性85%以上，同 時有3條以上的同源序列與該序列存在SSR位點差異。
[0059] (4)SSR分子標記引物設(shè)計
[0060] 根據(jù)SSR差異位點兩端的序列，采用Primer5. 0軟件對符合條件的目標序列設(shè)計 引物。設(shè)計引物參數(shù)原則：退火溫度為50°C~70°C，最佳溫度為57°C;引物長度18bp~ 24bp;產(chǎn)物大小為100bp~300bp;引物（G+C)含量為40%~60%，引物不出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)、 發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二聚體。引物由生工生物