應(yīng)用于組織樣本中組蛋白修飾染色體免疫共沉淀方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種應(yīng)用于組織樣本中組蛋白修飾染色體免疫共沉淀方法。
【背景技術(shù)】
[0002]組蛋白修飾是調(diào)控基因表達(dá)的重要表觀遺傳學(xué)機(jī)制，在保持細(xì)胞的全能性以及癌癥的病理過程中起到了重要的作用。組蛋白修飾染色體免疫共沉淀(Ch1matinImmunoprecipitat1n, ChIP)方法是研宄體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或組蛋白特異性修飾位點(diǎn)的研宄。將ChIP與第二代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。目前該方法普遍適用細(xì)胞樣本，而在臨床組織樣本應(yīng)用中尚未穩(wěn)定，且沒有達(dá)到廣泛應(yīng)用的目的，導(dǎo)致無法針對(duì)國(guó)內(nèi)重要疾病(肺癌、胃癌、肝癌等)進(jìn)行研宄。
[0003]目前ChIP-Seq技術(shù)中對(duì)染色體預(yù)處理方法均采用交聯(lián)方法ChIP (Cross-1 inkedChIP,以下簡(jiǎn)稱XChIP)，即用甲醛對(duì)DNA-蛋白質(zhì)進(jìn)行可逆的交聯(lián)反應(yīng)，用超聲波處理(sonicat1n)將染色體片段化。但是，XChIP的效果受到交聯(lián)時(shí)間、甲醛濃度、超聲波處理時(shí)間和強(qiáng)度等諸多因素影響，交聯(lián)一超聲波一解交聯(lián)三個(gè)步驟的實(shí)驗(yàn)條件需要協(xié)同探討。由于組織樣本與細(xì)胞樣本存在著很大的區(qū)別，在前期處理組織樣本上，需要進(jìn)行條件優(yōu)化，分離出細(xì)胞個(gè)體，達(dá)到抗體結(jié)合的最佳效率。另外由于組織的特異性，交聯(lián)效率和過程可能造成一些抗原決定簇被封閉掉，使得原本特異性很好的抗體在交聯(lián)處理后特異性降低，假陽性升高。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種應(yīng)用于組織樣本中組蛋白修飾染色體免疫共沉淀方法。
[0005]本發(fā)明的方法是采取用組織樣本個(gè)體細(xì)胞的分離、微球菌核酸酶(MicrococcalNuclease,以下簡(jiǎn)稱MNase)與超聲等各環(huán)節(jié)優(yōu)化技術(shù)相結(jié)合，來切割自然狀態(tài)下的染色體ChIP (簡(jiǎn)稱NXChIP)。ChIP前期時(shí)，優(yōu)化對(duì)組織樣本的無損傷式細(xì)胞個(gè)體分離，NXChIP采取酶切技術(shù)處理，從而減少ChIP的損失率；同時(shí)鑒于組蛋白H3和H4跟DNA結(jié)合非常緊密，因此在本方法中不進(jìn)行甲醛的前期固定。另外，用Mnase酶切割核小體之間的Iingker區(qū)，即可獲得單個(gè)的核小體。因此，該技術(shù)也很適合適合單個(gè)核小體(即核小體分辨率，Nucleosoome resolut1n)的研宄。同時(shí)也因?yàn)镸nase的這一特性使NChIP不適合用于非組蛋白的研宄，這時(shí)就需要用NXChIP來解決。
[0006]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0007]一種應(yīng)用于組織樣本中組蛋白修飾染色體免疫共沉淀方法，包括以下步驟:
[0008](I)組織樣本前處理:
[0009]取組織樣本切割成l-3mm3塊狀，加預(yù)冷的含有蛋白抑制劑的PBS洗滌劑(含I X蛋白抑制劑protein inhibitor，即稀釋至一倍)洗滌3次；所述的蛋白抑制劑具體由AEBSF> EDTA、Leupeptin 及 Pepstatin A 組成。
[0010](2)組織單細(xì)胞分離:
[0011]用組織研磨器，在冰浴中研磨后，用無菌紗布過濾，收集濾液，在顯微鏡下觀察，對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，收集活細(xì)胞(lOOOrpm, 1min)；
[0012](3)細(xì)胞裂解與酶消化:
[0013]收集步驟⑵濾液中的細(xì)胞，懸浮在酶切消化緩沖液(含有50mM Tris-HClUmMCaCl2、0.2v/v% Triton X-100 或 NP-40，pH 為 7.6)中，37°C水浴 2 分鐘；
[0014](4)微球菌核酸酶酶切反應(yīng):
[0015]將加入酶切消化緩沖液的細(xì)胞，加入酶活力為0.1-0.8U的微球菌核酸酶，37°C酶切5分鐘后，加入與微球菌核酸酶等量的酶切終止液(含有1mM Tris與5mM EDTA, pH為7.6)；
[0016](5)超聲破碎:
[0017]在冰浴下，使用B1ruptor超聲儀，對(duì)步驟(4)所得液進(jìn)行9000g高頻超聲5分鐘，然后4°C離心5分鐘，得到破碎的染色質(zhì)溶液；
[0018](6)抗體結(jié)合:
[0019]取Protein A/G，用500ml含5mg/ml牛血清白蛋白的PBS緩沖液洗滌三次后，加入250ul含5mg/ml牛血清白蛋白的PBS緩沖液，再加2_5ug抗體，4°C孵育2_4小時(shí)后，加入破碎的染色質(zhì)溶液，4°C過夜孵育；
[0020](7) ChIP 后的 DNA 提取:
[0021]孵育過后的溶液，在磁力架上用高鹽溶液多次洗滌，洗滌后用TE溶液(含有1mMTris與5mM EDTA, pH為7.6)洗脫磁力珠上的DNA，用純化液(體積比25:24:1的酚、氯仿與異戊醇的混合液)純化提取DNA，用超純水溶解DNA。
[0022](8)方法有效性評(píng)估:
[0023]用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢驗(yàn)ChIP的富集程度。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用組織樣本前期處理與細(xì)胞分離，能夠有效的提高抗體的沉淀效率；其次，采用酶切和超聲相結(jié)合的方法，不僅能夠有效的獲取染色質(zhì)片段，而且能夠得到染色質(zhì)上核小體，能夠在高通量水平上精準(zhǔn)定位組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，提尚了臨床樣本的檢測(cè)效果。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0026]實(shí)施例1
[0027]采取臨床肺腺癌組織樣本。具體方法如下:
[0028]在無菌條件下，采集約30-50mg肺腺癌組織，將組織切割成l_3mm3塊狀。加預(yù)冷的Iml PBS(含IX蛋白抑制劑protein inhibitor)洗滌3次；用組織研磨器，在冰浴中研磨后，用無菌紗布過濾，收集濾液，在顯微鏡下觀察，對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，收集1M(百萬)的活細(xì)胞(lOOOrpm, 1min)。收集細(xì)胞，懸浮在300ul酶切消化緩沖液(50mM Tris-HCl, pH7.6 ；ImM CaCl2；0.2% Triton X-100 (or NP-40))中，37 度水浴 2 分鐘。加入 0.4U 的 MNase 酶，37 度酶切 5 分鐘后，加入 300ul 酶切終止液(1mM Tris, pH7.6，5mM EDTA)。用 B1ruptor超聲儀高頻、冰浴超聲5分鐘，9000g，4度離心5分鐘，取出10ul溶液作為input。取1ulProtein A/G，加 500ml PBS (5mg/ml BSA)洗滌三次，加 250ul PBS (含有 5mg/ml BSA)，再加2-5ug抗體，4度孵育2-4小時(shí)后，加入破碎的染色質(zhì)溶液，4度過夜孵育。孵育過