用于檢測(cè)青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤狀病毒的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病毒TapMan熒光定量檢測(cè)試劑盒，確切講是一種用于檢測(cè)青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤HPVll亞型一步法TapMan熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤狀瘤(juvenile-onset recurrent respiratorypapilloma, JO-RRP)特指發(fā)生于上下呼吸道的乳頭瘤病，是一種由乳頭瘤狀病毒(humanpapillomavirus，HPV)病毒引起的具有高度復(fù)發(fā)性及侵襲性的疾病，可以發(fā)生于呼吸道任何部位，其中最易累積與鱗狀上皮與纖毛柱狀上皮交界處。JORRP患者首發(fā)癥狀主要是聲音撕?jiǎn)?，首發(fā)年齡最小為兩周，最大為14周歲，且病程表現(xiàn)多樣，個(gè)別患兒可以自發(fā)緩解，多數(shù)則呈現(xiàn)侵潤(rùn)生長(zhǎng)并需要多次手術(shù)甚至出現(xiàn)喉、氣管狹窄梗阻窒息死亡，臨床治療十分棘手。
[0003]HPV屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，是由8000個(gè)堿基組成的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，約有200余中亞型。根據(jù)病毒的基因組結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性和致病性，可分為五大類(lèi)，g卩α、β、Υ、μ和V，低危型的HPV6和HPVll屬于α乳頭瘤病毒。低危型與青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤狀瘤密切相關(guān)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者即已開(kāi)展了相關(guān)的治療研究，然而尚未建立有效的細(xì)胞培養(yǎng)模型或簡(jiǎn)便的病毒繁殖模型，難以進(jìn)行傳統(tǒng)的滅活疫苗或著監(jiān)督疫苗的研制。
[0004]研究認(rèn)為HPV的亞型與病情嚴(yán)重程度和臨床經(jīng)過(guò)相關(guān)，而且亞型之間存在毒力差異，因此臨床上能夠快速區(qū)分引起青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤狀病毒HPVll亞型顯得的尤為重要。常規(guī)PCR方法檢測(cè)靈敏度不高，且易出現(xiàn)假陽(yáng)性，已有的檢測(cè)性病HPVll亞型的SYBR Green熒光法屬于非飽和染料，不能完全飽和的嵌入DNA雙鏈中，會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種對(duì)可用于檢測(cè)青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤HPVll亞型的高度特異性引物對(duì)及探針，以及包括有這一高度特異性引物對(duì)及探針的可特異、敏感、快速和便捷的用于定量檢測(cè)青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤HPVll亞型的試劑盒。
[0006]本發(fā)明的用于檢測(cè)青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤狀病毒的高度特異性引物對(duì)，其序列分別為 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2。
[0007]本發(fā)明的用于檢測(cè)青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤狀病毒的試劑盒內(nèi)包括的高度特異序列為SEQ ID N0.3的探針。為使用方便，本發(fā)明的試劑盒內(nèi)還有2X0ne Step RT-PCRBuffer II1、TaKaRa Ex Taq HS (5U/ μ L)和 PrimeScript RT Enzyme Mix II 等擴(kuò)增所需要的所有實(shí)驗(yàn)試劑，檢測(cè)時(shí)只需按照說(shuō)明加入檢測(cè)樣品即可。
[0008]本發(fā)明的用于檢測(cè)青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤狀病毒的試劑盒內(nèi)還含有作為陰性對(duì)照的不含青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤HPVll亞型的DNA樣品和作為陽(yáng)性對(duì)照的含有青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤HPVll亞型的DNA樣品。
[0009]前述本發(fā)明的引物對(duì)優(yōu)選擴(kuò)增條件為:95°C 10sec，l個(gè)循環(huán)一95°C 1sec,55°C 30sec,72°C 30sec，40 個(gè)循環(huán)。
[0010]本發(fā)明的試劑盒實(shí)際上是一種一步法TapMan熒光定量PCR檢測(cè)的試劑盒。一步法TapMan熒光定量PCR檢測(cè)是使用5'端帶有熒光物質(zhì)，3'端帶有淬滅物質(zhì)的TapMan探針進(jìn)行熒光檢測(cè)，當(dāng)探針完整時(shí)，5'端熒光物質(zhì)受到3'端淬滅物質(zhì)的制約，不能發(fā)出熒光。而當(dāng)TapMan探針被分解后，5'端的熒光物質(zhì)便會(huì)游離出來(lái)，發(fā)出熒光。在PCR反應(yīng)中特異性探針和模板雜交，延伸是聚合酶活性可以分解與模板雜交的熒光探針，游離熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度，從而可以達(dá)到檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。在PCR使用本試劑盒進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)可在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單，并能有效防止污染。
[0011]利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤HPVll亞型一步法TapMan熒光定量PCR檢測(cè)，其優(yōu)點(diǎn)在于，根據(jù)青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤HPVll亞型流行株的LI基因保守涉及到兩條高度特異性引物和探針，在該病毒DNA提取的基礎(chǔ)上，對(duì)組織樣品進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對(duì)青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤HPVll亞型的定量檢測(cè)。
[0012]本發(fā)明用到的TaqMan探針?lè)獒槍?duì)青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤狀病毒HPVll亞型特異的核苷酸序列設(shè)計(jì)的探針，探針與模板是高度特異性結(jié)合，特異性和敏感性均高。填補(bǔ)了臨床上快速分型檢測(cè)青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤狀病毒HPVll亞型的空白。
[0013]本發(fā)明的試劑盒中有對(duì)青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤HPVll亞型LI基因序列比對(duì)后，根據(jù)保守區(qū)域優(yōu)化設(shè)計(jì)高度特異性引物和探針。在使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，是對(duì)青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤HPVll亞型DNA提取后直接進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，同時(shí)本發(fā)明對(duì)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使檢測(cè)PCR擴(kuò)增一步完成，簡(jiǎn)化了操作步驟，減少污染幾率，并能提高了檢測(cè)的精準(zhǔn)度，一步法TapMan熒光定量在擴(kuò)增完成后可直接進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量起始病毒拷貝數(shù)，同時(shí)其操作簡(jiǎn)單快捷，非常適用于分型檢測(cè)及該病毒流行病學(xué)調(diào)查的應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1:含青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤HPVll亞型LI基因序列重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖，
其中:M:2000bp DNA Marker
1:重組質(zhì)粒pMD-HPVl 1-Ll雙酶切鑒定
2:重組質(zhì)粒pMD- HPVll-Ll單酶切線(xiàn)性化
圖2 =HPVll 一步法TapMan熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線(xiàn)，其中:縱坐標(biāo)代表熒光量，橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)擴(kuò)增曲線(xiàn)從左到右表示目的DNA的拷貝數(shù)分別為2.59X 108-2.59 X 13;
圖3 =HPVll病毒一步法TapMan熒光定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中:縱坐標(biāo)代表Ct值。橫坐標(biāo)代表樣品的拷貝數(shù)，相關(guān)系數(shù)R2:0.999，擴(kuò)增效率Eff:101.1% ；
圖4:是檢測(cè)方法特異性的擴(kuò)增曲線(xiàn)；
圖5:是檢測(cè)方法敏感性的擴(kuò)增曲線(xiàn)，其中:縱坐標(biāo)代表熒光量，橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，擴(kuò)增曲線(xiàn)自左到右的DNA的拷貝數(shù)分別為I X 18-1XlO1tj
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合具體實(shí)例和【附圖說(shuō)明】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明
一、青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤HPVll亞型熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)與合成
利用已知的青少年復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤HPVll亞型LI基因序列比對(duì)后，根據(jù)保守區(qū)域利用Primer Express3.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針,送寶生物工程(大連)有限公司合成。上下游引物及探針?lè)謩e為:
SEQ ID N0.1: (HPVll-F) 5’ - TCCTCCTAACCCTGTATC -3’
SEQ ID N0.2: (HPVll-R) 5’ - TGCTGGCATGATAAAATATG -3，
SEQ ID