部分除了靶結(jié)合以外展示其他功能或展示其他功能而不是靶結(jié)合。一個(gè)實(shí)例 是一種或更多種白蛋白結(jié)合多肽與作為報(bào)告物或效應(yīng)部分的酶促活性多肽之間的融合?？?以與白蛋白結(jié)合多肽偶聯(lián)以形成融合蛋白的報(bào)告酶的實(shí)例，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且 包括例如0半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶和羧肽酶。用于根據(jù)本發(fā)明的融合 蛋白或綴合物的第二和另外的一個(gè)或更多個(gè)部分的其他選擇包括也不限于，熒光多肽，例 如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、螢光素酶和其變體。
[0099] 在本發(fā)明這一方面的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了融合蛋白或綴合物，其中另外的部 分由具有其他期望生物活性的多肽組成，這種期望的生物活性可以和第二部分的相同或不 同。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，第二部分可以選自治療活性多肽、人內(nèi)源酶、激素、生長(zhǎng)因 子、趨化因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、IL-2、GLP-1、BNP、IL-1受體拮抗劑、KGF、Stemgen?、 611、6-05?、(：1'1^-4、肌肉生長(zhǎng)抑制素、因子￥11、因子￥111、因子^和因子乂以及非人生物活 性蛋白，選自由細(xì)菌毒素、酶和活化蛋白組成的組，并且另外的部分可以包括能夠和如上定 義的靶分子選擇性相互作用的結(jié)合多肽。在另一特定的實(shí)施方案中，第二和另外的部分各 自包括能夠和如上定義的靶分子選擇性相互作用的結(jié)合多肽。
[0100] 關(guān)于本文對(duì)并入根據(jù)本發(fā)明的白蛋白結(jié)合多肽的融合蛋白或綴合物的描述，應(yīng)該 注意的對(duì)第一、第二和另外的部分的命名是為了清楚的原因，以區(qū)分一方面根據(jù)本發(fā)明的 一種或更多種白蛋白結(jié)合多肽和另一方面展示其他功能的部分。這些名稱不意圖指融合蛋 白或綴合物的多肽鏈中不同結(jié)構(gòu)域的實(shí)際順序。因此，例如，所述第一部分可以沒(méi)有限制的 出現(xiàn)在融合蛋白或綴合物的N末端，在中間或在C末端。
[0101] 在根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的綴合物的一個(gè)實(shí)施方案中，第二部分經(jīng)由向白蛋白結(jié)合多肽 的N或C末端添加的賴氨酸或半胱氨酸殘基或經(jīng)由在白蛋白結(jié)合多肽中賴氨酸或絲氨酸殘 基出現(xiàn)的位置的賴氨酸或絲氨酸殘基與白蛋白結(jié)合多肽綴合。例如如果白蛋白結(jié)合多肽包 括以上公開(kāi)的46個(gè)氨基酸的序列，綴合可以在選自X3、&和X14的位置進(jìn)行。如果綴合位 點(diǎn)是白蛋白結(jié)合多肽的氨基酸序列中的一個(gè)，例如46-mer的位置X14中的半胱氨酸，不需要 添加另外的氨基酸到白蛋白結(jié)合多肽用于使得能夠綴合第二部分的目的。因此，在這方面 的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了綴合物，其中第二部分經(jīng)由存在于對(duì)應(yīng)公開(kāi)的46-mer的X14位置 的所述第一部分的位置的任何半胱氨酸殘基的巰基綴合到第一部分。
[0102] 在相關(guān)的方面，提供了如本公開(kāi)內(nèi)容定義的白蛋白結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物， 還包括有機(jī)分子，例如細(xì)胞毒性劑?？梢耘c根據(jù)第一方面的白蛋白結(jié)合多肽融合或綴合， 或與根據(jù)第二方面的融合蛋白或綴合物組合的細(xì)胞毒性劑的非限制性實(shí)例選自刺孢毒素、 auristatin、阿霉素、美登素（maytansinoid)、紫杉醇、海鞘素（ecteinascidin)、格爾德 霉素、甲氨蝶呤和它們的衍生物以及其組合。以前已經(jīng)嘗試了使用直接白蛋白綴合物治 療各種紊亂。這樣的直接白蛋白綴合物在例如癌癥中與阿霉素一起利用（Kratz等人，J MedChem45:5523-33, 2002)和在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中與甲氨蝶呤一起利用（Wunder等人，J Immunol170:4793 - 4801,2003)。應(yīng)該被理解的是，白蛋白結(jié)合多肽自身或作為融合蛋白 或綴合物中的部分，通過(guò)它的高白蛋白結(jié)合能力提供了構(gòu)建白蛋白復(fù)合物的間接手段，并 且因此相比于以上提到的嘗試可以提供可選的治療選擇。
[0103] 以上方面還包含多肽，其中根據(jù)第一方面的白蛋白結(jié)合多肽，或根據(jù)第二方面作 為包括在融合蛋白或綴合物中的白蛋白結(jié)合多肽，例如為了多肽檢測(cè)目的被設(shè)有標(biāo)記基 團(tuán)，例如，選自由熒光染料和金屬、發(fā)色團(tuán)染料、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光蛋白質(zhì)、酶、放 射性核素和顆粒組成的組的標(biāo)記物。特別地，本公開(kāi)內(nèi)容包含由如本文描述的白蛋白結(jié)合 多肽、融合蛋白或綴合物的放射性螯合物和放射性核素，例如放射活性金屬組成的放射性 標(biāo)記的多肽。
[0104] 在其中標(biāo)記的白蛋白結(jié)合多肽包括根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的第一方面的白蛋白結(jié)合多 肽和標(biāo)記物的實(shí)施方案中，標(biāo)記的多肽例如可以被用于間接標(biāo)記血清白蛋白。由于標(biāo)記的 多肽和血清白蛋白之間的強(qiáng)的締合，標(biāo)記的多肽可被用于例如研宄血管滲透性和血池。
[0105] 在其他實(shí)施方案中，標(biāo)記的白蛋白結(jié)合多肽作為還包括具有期望生物活性的第二 部分的融合蛋白或綴合物中的部分出現(xiàn)。標(biāo)記物在一些情況下可以僅僅與白蛋白結(jié)合多肽 偶聯(lián)，以及在一些情況下與白蛋白結(jié)合多肽和綴合物或融合蛋白的第二部分二者偶聯(lián)。此 外，標(biāo)記物可以僅僅與第二部分而不是白蛋白結(jié)合部分偶聯(lián)也是可能的。因此，在又另一實(shí) 施方案中，提供了包括第二部分的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述標(biāo)記物僅僅與第二部分偶聯(lián)。 當(dāng)提及標(biāo)記的多肽時(shí)，應(yīng)該理解為提及如本文描述的多肽的所有方面，包括包含白蛋白結(jié) 合多肽和第二部分以及任選地另外的部分的融合蛋白和綴合物。因此，標(biāo)記的多肽可以僅 僅包含白蛋白結(jié)合多肽和例如治療放射性核素，所述治療放射性核素可以與白蛋白結(jié)合多 肽螯合或共價(jià)偶聯(lián)，或包含白蛋白結(jié)合多肽、治療放射性核素和第二部分諸如具有例如治 療效應(yīng)的期望的生物活性的小分子。
[0106] 在白蛋白結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物被放射性標(biāo)記的實(shí)施方案中，這樣的放射 性標(biāo)記的多肽可包括放射性核素。大多數(shù)放射性核素具有金屬性質(zhì)并且金屬典型地與蛋 白和肽中存在的元素不能夠形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。由于這個(gè)原因，用放射性金屬標(biāo)記蛋白和 肽使用螯合劑即多齒配體來(lái)執(zhí)行，所述多齒配體與金屬離子形成稱為螯合物的非共價(jià)化合 物。在白蛋白結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物的實(shí)施方案中，放射性核素的摻入通過(guò)提供螯合 環(huán)境實(shí)現(xiàn)，放射性核素通過(guò)所述螯合環(huán)境可與多肽配位、螯合或絡(luò)合。
[0107] 螯合劑的一個(gè)實(shí)例是多胺多羧酸類型的螯合劑。兩類這樣的多胺多羧酸螯合劑可 以分為：大環(huán)的和無(wú)環(huán)的螯合劑。
[0108] 在一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物包括由多胺多羧酸螯合 劑提供的經(jīng)由半胱氨酸殘基的巰基或賴氨酸殘基的e胺基與白蛋白結(jié)合多肽綴合的螯合 環(huán)境。
[0109] 用于銦、鎵、釔、鉍、放射性錒和放射性鑭的放射性同位素的最常用的大環(huán)螯合劑 是D0TA(1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸）的不同的衍生物。在一個(gè)實(shí)施方 案中，白蛋白結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物的螯合環(huán)境由DOTA或相應(yīng)衍生物提供。更具體 地，在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容包含的螯合多肽通過(guò)D0TA衍生物1，4, 7, 10-四氮雜環(huán) 十二烷-1，4, 7-三乙酸-10-馬來(lái)酰亞胺乙基乙酰胺（馬來(lái)酰亞胺單酰胺-D0TA)與所述多 肽發(fā)生反應(yīng)獲得。
[0110] 此外，1，4, 7-三氮雜環(huán)壬烷-1，4, 7-三乙酸（N0TA)和其衍生物可以被用作螯合 劑。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中。提供了白蛋白結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物，其中多胺多羧 酸螯合劑是1，4, 7-三氮雜環(huán)壬烷-1，4, 7-三乙酸或其衍生物。
[0111] 最常用的無(wú)環(huán)多胺多羧酸螯合劑是DTPA(二乙烯三胺五乙酸）的不同衍生物。因 此，具有二乙烯三胺五乙酸或相應(yīng)衍生物提供的螯合環(huán)境的多肽也被包含在本公開(kāi)內(nèi)容 中。
[0112] 在本發(fā)明的第三方面中，提供了編碼如本文描述的白蛋白結(jié)合多肽或融合蛋白的 多核苷酸。
[0113] 還涵蓋制備如以上描述的白蛋白結(jié)合多肽或融合蛋白的方法，該方法包括表達(dá)多 核苷酸；包括該多核苷酸的表達(dá)載體和包括該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0114] 還涵蓋制備多肽的方法，該方法包括在允許從所述表達(dá)載體表達(dá)所述多肽的條件 下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，以及分離多肽。
[0115] 本公開(kāi)內(nèi)容的白蛋白結(jié)合多肽可以可選地使用具有受保護(hù)的反應(yīng)側(cè)鏈的氨基酸 和/或氨基酸衍生物通過(guò)非生物肽合成制備，該非生物肽合成包括：
[0116] 逐步偶聯(lián)氨基酸和/或氨基酸衍生物以形成根據(jù)第一方面的具有受保護(hù)的反應(yīng) 側(cè)鏈的多肽，
[0117] 從多肽的反應(yīng)側(cè)鏈除去保護(hù)基團(tuán)，以及
[0118] 多肽在水溶液中的折疊。
[0119] 盡管本發(fā)明已經(jīng)參考各種示例性實(shí)施方案描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是可 以做出各種變化和等同物可以替代其元素的而不背離本發(fā)明的范圍。此外，可做出許多修 改以按照本發(fā)明的教導(dǎo)適應(yīng)特定的情形或分子而不背離其基本范圍。因此，意圖是本發(fā)明 不受限于預(yù)計(jì)用于實(shí)施本發(fā)明的任何特別的實(shí)施方案，而是本發(fā)明將包括落入附加權(quán)利要 求書(shū)的范圍的所有實(shí)施方案。
[0120] 附圖簡(jiǎn)沐
[0121] 圖1是包含在本發(fā)明的白蛋白結(jié)合多肽中的白蛋白結(jié)合基序的實(shí)例（SEQID N0:l-8)、根據(jù)本發(fā)明的白蛋白結(jié)合多肽的實(shí)例（SEQIDN0:9-24)和對(duì)照多肽（SEQID N0:25(PEP12381)、26(PEP12379)、27(PEP07843)和 28(PEP06923))的氨基酸序列的列表。
[0122] 圖 2 顯示了所示白蛋白結(jié)合多肽PEP12379(SEQIDN0:26)、PEP12380(SEQID N0:17)、PEP12381(SEQIDN0:25)和PEP07843(SEQIDN0:27)在熱處理之前和之后的四 種⑶光譜的疊加。
[0123] 圖3顯示了所示白蛋白結(jié)合多肽與梭菌蛋白酶一起孵育多達(dá)22小時(shí)的樣品的 SDS-PAGE分析結(jié)果。
[0124] 圖4顯示了所示白蛋白結(jié)合多肽與每毫克多肽0. 2U梭菌蛋白酶一起孵育多達(dá)22 小時(shí)的樣品的LC/MS分析結(jié)果。
[0125] 圖5顯不了所不白蛋白結(jié)合多狀與每暈克多狀5U梭菌蛋白酶一起f桴育多達(dá)22小 時(shí)的樣品的LC/MS分析結(jié)果。
[0126] 圖6顯示了與每毫克多肽5U梭菌蛋白酶一起孵育多達(dá)22小時(shí)的PEP12380(S