Single-stranded oligodeoxynucleotide mutational vectors (2001. 8· 7 授權(quán)））。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案中，添加一個(gè)或多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)以提供進(jìn)一步的對mRNA降解的保護(hù)。在該實(shí)施方案 的一個(gè)方面，額外的莖環(huán)結(jié)構(gòu)是通過PCR擴(kuò)增獲得的。在在另一方面，本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步 的實(shí)施方案中，刪除一個(gè)或多個(gè)現(xiàn)存的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，例如通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的位 點(diǎn)特異性限制酶。
[0067] 在某些實(shí)施方案中，就位于一個(gè)或多個(gè)感興趣的結(jié)構(gòu)基因的適宜區(qū)域的側(cè)翼而 言，本發(fā)明的5'和/或3' Ubil UTR是彼此聯(lián)合使用的。然而，本發(fā)明不限于此方式。因 此，例如，本發(fā)明的5'或3'Ubil UTR之一或二者可以與下述者聯(lián)合使用：感興趣的結(jié)構(gòu)基 因的天然UTR、對感興趣的結(jié)構(gòu)基因和Ubil基因異源的UTR、或此類天然或異源UTR之外附 加的UTR。
[0068] 用于本發(fā)明的5'和/或3' Ubil UTR可以使用本領(lǐng)域已知的核酸雜交技術(shù)（例 如使用本申請公開的核苷酸序列或其部分作為雜交探針）加以分離。此類探針可以由整個(gè) Ubil基因或其部分，包括本申請鑒定的5'和3'UTR組成。主題的5'和/或3'Ubil UTR 也可以是合成的，使用上述的序列和本領(lǐng)域中已知的核酸合成技術(shù)獲得。
[0069] 通過已知的克隆技術(shù)將感興趣的結(jié)構(gòu)核酸序列與分離自或衍生自Ubil基因的5' 和/或3'Ubil UTR控制序列可操作地連接。感興趣的結(jié)構(gòu)核酸序列相對于受體植物、植物 細(xì)胞、或植物組織中天然存在的基因而言可以是異源的或者是同源的。在任一情況下，本發(fā) 明的5'和/或3' Ubil UTR均可用于調(diào)節(jié)感興趣的核酸序列的翻譯效率以：增加被轉(zhuǎn)錄的 mRNA的半衰期；和/或以比如果沒有使用本發(fā)明的5'和/或3'Ubil UTR表達(dá)的豐度高的 豐度在植物組織中表達(dá)感興趣的結(jié)構(gòu)核酸序列編碼的蛋白質(zhì)。另外特別考慮到的是在這樣 的基因構(gòu)建體中使用本發(fā)明，該基因構(gòu)建體被工程改造使得由感興趣的結(jié)構(gòu)基因序列編碼 的蛋白質(zhì)僅在植物的特定優(yōu)選的組織中，例如根、葉或莖中，而不在種子中表達(dá)。
[0070] 本發(fā)明一般地可適用于在單子葉植物和雙子葉植物中表達(dá)感興趣的基因。因此， 本發(fā)明適用于任何單子葉植物家族的任何成員，包括但不限于玉米、水稻、大麥、燕麥、小 麥、高粱、黑麥、甘鹿、菠蘿、薯菌（yams)、洋蔥、香蕉、椰子、和賽（dates)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu) 選的應(yīng)用是應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因玉米植物的生產(chǎn)中。適用于本發(fā)明的雙子葉植物種類包括，但不 限于，煙草、西紅柿、向日葵、棉花、糖用甜菜、馬鈴薯、萵苣、甜瓜、大豆和芥花（canola)(油 菜）。
[0071] 本發(fā)明的構(gòu)建體中使用的感興趣的結(jié)構(gòu)基因序列可以是任何這樣的核酸序列：其 為產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的有益的特征提供條件，或者增強(qiáng)這樣的特征。特別有用的核酸序列 編碼蛋白質(zhì)或反義RNA轉(zhuǎn)錄物，以促進(jìn)增加的營養(yǎng)價(jià)值、更高的產(chǎn)率、對除草劑、昆蟲或疾 病的耐性等等。更優(yōu)選地，所述核酸序列會是這樣的有用基因，它們由于自身相對較大的大 小（長度至少4_5kb)，已知這樣的大小會使基因更易于物理、化學(xué)或酶促降解而固有地不 穩(wěn)定。由于其大小而固有地不穩(wěn)定的基因包括來自異短桿菌屬（Xenorhabdus)(見美國專 利6, 048, 838)的和發(fā)光短桿菌屬的殺蟲蛋白基因（例如毒素 A)
[0072] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)感興趣的結(jié)構(gòu)基因的側(cè)翼有一個(gè) 或多個(gè)本發(fā)明的Ubil UTR/控制序列，它們在特定的作物品種中被相互"疊加"。短語"疊 加"是指多個(gè)感興趣的結(jié)構(gòu)基因，每個(gè)感興趣的結(jié)構(gòu)基因優(yōu)選地賦予產(chǎn)業(yè)上期望的性狀，已 經(jīng)被轉(zhuǎn)基因地導(dǎo)入到單一作物品種中（近交種或雜種）。例如，具有疊加基因的玉米雜種可 能既含有昆蟲抗性的基因（例如CrylF B.t.基因），又含有除草劑抗性基因（例如草甘膦 抗性基因）。
[0073] 在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的Ubil UTR/控制序列與來自發(fā)光短桿菌 的毒素 A基因功能連接，再與一個(gè)或多個(gè)殺蟲劑和/或除草劑抗性基因在單一作物品種 中疊加。在某些實(shí)施方案中，除草劑基因?qū)碜蕴K云金芽孢桿菌或異短桿菌屬的某些種 (Xenorhabdus spp.)，而除草劑基因會是草胺膦、草甘膦、咪挫啉酮、或2, 4-D、或磺酰脲抗 性基因中的一種或多種。當(dāng)然，任何"疊加"的殺蟲劑或除草劑基因可以與本發(fā)明的Ubil UTR功能連接。
[0074] 感興趣的結(jié)構(gòu)基因序列可以完全或部分來源于細(xì)菌基因組或附加體，真和基因 組、線粒體或質(zhì)體DNA、cDNA、病毒核酸、或化學(xué)合成的核酸。設(shè)想感興趣的結(jié)構(gòu)基因序列在 可能影響表達(dá)產(chǎn)物的生物活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)、表達(dá)速率、或表達(dá)控制方式的編碼區(qū)中可以含 有一個(gè)或更多修飾。這樣的修飾包括但不限于突變、插入、缺失（或稱刪除）、重排、以及一 個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代。感興趣的結(jié)構(gòu)基因序列可以構(gòu)成不間斷的編碼序列，或者其可以 包括一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子以合適的植物-功能剪接結(jié)點(diǎn)所界定。感興趣的結(jié)構(gòu)基因 序列可以是來源于多個(gè)來源，包括天然或合成來源的節(jié)段的集合。感興趣的結(jié)構(gòu)基因序列 還可以編碼融合蛋白，只要實(shí)驗(yàn)操作在接合各編碼序列的過程中維持功能性。
[0075] 在實(shí)施本發(fā)明的過程中，利用克隆技術(shù)來獲得含有側(cè)翼于感興趣的結(jié)構(gòu)基因的5' 和/或3'Ubil UTR的載體，用于接下來導(dǎo)入期望的宿主細(xì)胞。因此，可以利用本領(lǐng)域中標(biāo) 準(zhǔn)的克隆步驟，例如 J. Sambrook et al. ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2d ed·，1989)和 Ausubel，F(xiàn).M.et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, N.Y.(二者均通過提述并 入本申請）中描述的那些，將5'和/或3' Ubil UTR、感興趣的結(jié)構(gòu)基因序列、以及任何期 望的啟動子、增強(qiáng)子、可選擇標(biāo)記等分離并克隆到載體中。
[0076] 有多種多樣的如下所述的克隆載體可供使用，或者可以制備：其中克隆載體包 含在期望的植物物種中有功能的基因構(gòu)建體。示例性的載體包括例如pBR322，pUC系 列，pACYC184, Bluescript系列（Stratagene)，等等。因此，這樣的載體是可商購的，或者可 以容易地制備用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。在一般情況下，質(zhì)?；虿《据d體將包含在給定宿主中維 護(hù)和表達(dá)異源DNA序列必要的核酸序列。選擇適當(dāng)?shù)脑栽谌魏翁囟ǖ奈锓N中實(shí)現(xiàn)優(yōu)化 表達(dá)，是利用本公開的教導(dǎo)實(shí)施本領(lǐng)域的普通技術(shù)的范疇。合適的DNA成分，選擇性標(biāo)記基 因，報(bào)道基因，增強(qiáng)子，內(nèi)含子等在K. Weising et al·，Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988)中 描述。
[0077] 通常情況下，將感興趣的結(jié)構(gòu)基因序列和5'和/或3' UBIl UTR插入在適當(dāng)?shù)目?隆載體的適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)處，使得感興趣的結(jié)構(gòu)基因可操作地連接到所需的啟動子，且 和5'和/或3'UTR UBIl與感興趣的結(jié)構(gòu)基因序列功能連接。在制備本發(fā)明的基因構(gòu)建體 時(shí)，可操作各核酸片段，以便提供具有適當(dāng)取向，以及視需要，處于適當(dāng)?shù)拈喿x框中的核酸 序列。當(dāng)然，可以使用銜接子或接頭連接核酸片段，或可以包括其他操作以提供方便的限制 性位點(diǎn)，移除多余DNA，移除限制性位點(diǎn)等等。
[0078] 本發(fā)明中采用的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)可以通過任何數(shù)目的啟動子來驅(qū)動。雖然 本申請中可以使用感興趣的結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)源啟動子進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，但在一些實(shí) 施方案中，啟動子是外來調(diào)節(jié)序列。對于植物表達(dá)載體，合適的病毒啟動子包括木薯 葉脈花葉病毒啟動子（Verdaguer et al·，Plant Mol. Biol.31 (6): 1129-39 (1996); 花椰菜花葉病毒（CaMV)的 35S RNA 和 19S RNA 啟動子（Brisson et al.，Nature 310:511(1984) ;0dell et al. ,Nature, 313:810(1985);增強(qiáng)的和雙增強(qiáng)的 CaMV35S 啟 動子（Kay et al·，Science 236:1299-1302(1987);來自玄參花葉病毒（FMV)的全長 轉(zhuǎn)錄物啟動子（Gowda et al.，J. Cell Biochem.，13D:301, 1989)和來自 TMV 的外殼蛋 白啟動子（Takamatsu et al.，EMBO J. 6:307,1987)。其他有用的啟動子包括來自小 亞基核酮糖1,5-二磷酸羧化酶加氧酶（ssRUBISCO)的光誘導(dǎo)型啟動子（Coruzzi et al·，EMBO J. ,3:1671 (1984) ;Broglie，et al·，Science 224:838(1984);水稻肌動蛋 白啟動子（McElroy et al·，Plant Cell. 2(2) :163-71 (1990);和 Adhl 啟動子（Dennis et al. ,Nucleic Acids Res. 12(9):3983-4000(1984));甘露堿合酶啟動子（Velten et al.，EMBO J.，3:2723, 1984);胭脂堿合酶（NOS)和章魚堿合酶（OCS)啟動子（攜帶在根癌 土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上），或熱休克啟動子，例如大豆hspl7. 5-E或hspl7. 3-B(Gurley et al., Mol. Cell. Biol. 6:559(1986) ；Severin et al., Plant Mol. Biol. 15:827, (1990))〇
[0079] 通?？梢赃M(jìn)行對克隆步驟的分析，分析可能涉及序列分析，限制酶切分析，電泳， 等等。每次操作后，可將最終的構(gòu)建體中要使用的DNA序列限制酶切出來，并且連接到下一 個(gè)序列，其中各個(gè)部分構(gòu)建體可以克隆到相同或不同的質(zhì)粒中。
[0080] 一旦克隆步驟已經(jīng)完成，有多種技術(shù)可供用于導(dǎo)入，植株再生，穩(wěn)定整合、和在 植物細(xì)胞中表達(dá)包含感興趣的異源基因的外來重組載體。一種這樣的技術(shù)涉及將包被 有遺傳物質(zhì)的微粒加速直接引入植物細(xì)胞（美國專利4, 945, 050,授予Cornell ;美國專 利 5, 141，131，授予 DowElanco ;美國專利 5, 538, 877 和 5, 538, 880,均授予 Dekalb)。該 技術(shù)現(xiàn)在通常稱為"微粒轟擊"或"轟擊"。還可以使用土壤桿菌技術(shù)來轉(zhuǎn)化（美國專利 5, 177, 010,授予 University of Toledo,美國專利 5, 104, 310,授予 Texas A&M,歐洲專利 申請 0131624B1,歐洲專利申請 120516, 159418B1 和 176, 112,授予 Schilperoot ;美國專 利 5, 149, 645, 5, 469, 976, 5, 464, 763 和 4, 940, 838 和 4, 693, 976,授予 Schilperoot,歐洲 專利申請116718, 290799, 320500均授予Max Planck,歐洲專利申請604662, 627752和美 國專利5, 591，616,授予Japan Tobacco ;歐洲專利申請0267159,和0292435和美國專利 5, 231，019,均授予 Ciba-Geigy ;美國專利 5, 463, 174 和 4, 762, 785,均授予 Calgene ;和美 國專利5, 004, 863和5, 159, 135,均授予Agracetus)。另一種轉(zhuǎn)化方法設(shè)計(jì)使用延長的針 狀微纖維或稱"晶須"（"whiskers"）來轉(zhuǎn)化玉米細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物（美國專利5, 302, 523 和5, 464, 765,均授予Zeneca)。此外，已經(jīng)利用電轉(zhuǎn)化技術(shù)來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，從其獲得 了能育的植物（W0 87/06614,授予 Boyce Thompson Institute;美國專利 5, 472,869 和 5, 384, 253,均授予 Dekalb ;美國專利 5, 679, 558, 5, 641，664, W09209696 和 W09321335,授予 Plant Genetic Systems)〇
[0081] 其他用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的技術(shù)包括：直接DNA攝取機(jī)制（見Mandel and Higa, J. Mol. Biol. , 53:159-162(1972) ；Dityatkin