瓜核屯、種質(zhì)，并對該 115份黃瓜核屯、種質(zhì)材料進(jìn)行重測序分析。生物信息比較分析無卷須黃瓜材料與其它114 份材料的基因組序列，從360萬個SNP中，篩選到無卷須黃瓜材料特有的1018個稀有SNP， 其中導(dǎo)致異義突變的稀有SNP數(shù)目為75個，分別對應(yīng)著75個基因，并結(jié)合黃瓜轉(zhuǎn)錄組分 析，發(fā)現(xiàn)了一個只在卷須組織里特異表達(dá)的基因Csa5G644520,并推測該基因控制黃瓜卷須 發(fā)育，該基因上的稀有SNP是導(dǎo)致黃瓜卷須表型改變的關(guān)鍵位點(diǎn)。與卷須表型相關(guān)的稀有 SNP位點(diǎn)（圖1)，該SNP位點(diǎn)位于編碼Csa5G644520蛋白的基因序列第1012bp處，由A突 變?yōu)門，該突變導(dǎo)致Csa5G644520蛋白的338位氨基酸從天冬酷胺變?yōu)槔野彼?。?14份有 卷須的黃瓜材料在該位點(diǎn)都是A，1份無卷須的黃瓜在該位點(diǎn)是T。同時，對F2群體中隨機(jī) 挑選的100個單株進(jìn)行PCR測序，檢測結(jié)果表明與卷須表型相關(guān)的稀有SNP位點(diǎn)的信息與 單株的表型性狀完全符合，為共分離SNP標(biāo)記。
[0035] 其中，黃瓜Csa5G644520蛋白的氨基酸序列及編碼該蛋白的基因Csa5G644520序 列分別如SEQ ID No. 1和2所示。
[0036] 設(shè)計用于擴(kuò)增與黃瓜卷須性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物對，包括正向引物F 5'-CTAGGGAAAGGACTAAGGAGAA-3' 和反向引物 R 5'-AGTCAAATTGGAAGCTGGAAAA-3'。擴(kuò)增 出待測SNP所在的核巧酸片段，如SEQ ID ^.3所示。該5^位點(diǎn)位于該？0?擴(kuò)增片段的 240bp處，該處堿基可W為T或A。
[0037] 其中，PCR 反應(yīng)體系 W20yl 計為；10-20ng/yl 模板 DNA lyl，10pmol/yl 引物 F和 R各 lyl，10mmol/L dNTP mix 0.4yl，0.5U/yL hgONA 聚合酶 0.3yl，10XPCR反應(yīng) 緩沖液2 y 1，余量為水。
[0038] PCR 反應(yīng)條件為；94 °C 5 分鐘；94 °C 20 秒，55 °C 20 秒，72 °C 30 秒，35 個循環(huán)； 72 °C 10 分鐘。
[0039] 實(shí)施例2控制黃瓜無卷須性狀的基因Csa5G644520的遺傳初定位
[0040] 為了驗(yàn)證Csa5G644520就是控制黃瓜卷須發(fā)育的基因，應(yīng)用圖位克隆的方法進(jìn)行 驗(yàn)證。用無卷須的黃瓜資源（tltl)和一份有卷須的黃瓜資源（T1T1)構(gòu)建了 6623單株的 巧代群體，首先隨機(jī)挑選了 186個單株，對無卷須tl基因進(jìn)行了初步定位，初定位將tl基 因定位在SSR19343和SSR0618兩個標(biāo)記之間，遺傳距離為3. 4cM(圖2)。
[0041] 實(shí)施例3控制黃瓜無卷須性狀的基因的克隆
[0042] 為了克隆黃瓜無卷須基因tl，選用初定位的兩個標(biāo)記SSR19343和SSR20486篩選 余下的巧群體（6437個單株）中篩選，同時在初定位的基礎(chǔ)上向內(nèi)開發(fā)Indel標(biāo)記和SNP 標(biāo)記，并檢測篩選得到的重組單株，最終將tl基因定位在物理距離約18化范圍內(nèi)，該范圍 內(nèi)僅有1個基因Csa5G644520,即Csa5G644520基因就是黃瓜無卷須基因tl，且與黃瓜卷須 表型相關(guān)的稀有SNP (即SNPl)位于Csa5G644520基因的外顯子上（圖3)。
[0043] 實(shí)施例4控制黃瓜無卷須性狀的SNP的確認(rèn)證明
[0044] 我們分析了 115份核屯、種質(zhì)在SNP35和SNP47的之間的18化范圍內(nèi)的所有變異 (包括SNP、InDel和SV等），發(fā)現(xiàn)有2份有卷須種質(zhì)巧930和CG8216)在該18化區(qū)域內(nèi)與 無卷須種質(zhì)（tltl)除了存在SNP1的唯一差異，其余區(qū)域序列完全一致（圖4)，由此證明 Csa5G644520基因就是控制黃瓜無卷須性狀基因tl，SNPl (圖4)即為無卷須性狀產(chǎn)生的原 因。
[0045] 實(shí)施例5控制黃瓜無卷須性狀的SNP標(biāo)記的獲得W及該標(biāo)記在世界范圍3342份 黃瓜資源的驗(yàn)證
[0046] 為了進(jìn)一步驗(yàn)證Csa5G644520基因上的稀有SNP1是導(dǎo)致無卷須性狀產(chǎn)生的原因， 我們針對稀有SNP1開發(fā)dcaps標(biāo)記，在3342份黃瓜資源中進(jìn)行驗(yàn)證（圖5)。
[0047] 5. 1目的片段的獲得W及dCAPS分型檢測
[0048] (1)擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的核巧酸片段
[0049] 正向引物 F 5' -AATAATATCATTGGGATCATGTGG-3' 和反向引物 R 5' -TTGGAAGCTGGAAAATAGAAAATAT-3'，擴(kuò)增出待測SNP所在的核巧酸片段。
[0050] 其中，PCR 反應(yīng)體系 W20yl 計為；10-20ng/yl 模板 DNA lyl，10pmol/yl 引物 F和 R各 lyl，10mmol/L dNTP mix 0.4yl，0.5U/yL hgONA 聚合酶 0.3yl，10XPCR反應(yīng) 緩沖液2 y 1，余量為水。
[0051] PCR 反應(yīng)條件為；94°C4 分鐘；94°C20 秒，55°C20 秒，72°C30 秒，35 個循環(huán)；72°C5 分鐘。
[0化引 （2)對PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切，進(jìn)行dCAI^S檢測
[0化引所得PCR產(chǎn)物用內(nèi)切酶SspI酶切，反應(yīng)體系W 20y 1計為；lOU/yLSspI內(nèi)切酶 0.5yl，10X肥B緩沖液2yl，10yg/yl100 XBSA0.2yl，PCR產(chǎn)物10yl，余量為水。反 應(yīng)條件為；37°C溫育4小時。然后將得到的酶切產(chǎn)物在聚丙締酷胺凝膠中電泳，銀染顯色觀 察。
[0化4] 5. 2基因型判定及卷須性狀關(guān)聯(lián)分析
[0化5] 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有無卷須種質(zhì)僅為一條140bp大小的條帶，即在如Seq ID No. 2 所示的控制黃瓜無卷須性狀的基因Csa5G644520序列第1012bp處為堿基T ;其余3341份 有卷須黃瓜資源檢測結(jié)果只有一條117bp條帶，即在如Seq ID No. 2所示的控制黃瓜無卷 須性狀的基因Csa5G644520序列第1012bp處為堿基A ;無卷須種質(zhì)的雜合F1代（有卷須 性狀）同時含有140bp和117bp兩條帶，即在位于如Seq ID No. 2所示的控制黃瓜無卷須 性狀的基因Csa5G644520序列第1012bp處的堿基為A/T雜合（圖5)。
[0化6] 進(jìn)一步有力證明Csa5G644520基因就是控制黃瓜無卷須性狀基因tl，SNP1就是無 卷須性狀產(chǎn)生的原因。
[0化7] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可W對之作一些修改或改進(jìn)，該對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的該些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項】
1. 黃瓜Csa5G644520蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，或該序列 經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 控制黃瓜無卷須性狀的基因 Csa5G64452,其特征在于，其核苷酸序列為： i) Seq ID No. 2所示的核苷酸序列；或 ii) 在嚴(yán)格條件下與Seq ID No. 2所示序列雜交的核苷酸序列； 所述嚴(yán)格條件為在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0. 1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在 65°C下雜交，并用該溶液洗膜。
3. 含有權(quán)利要求2所述基因 Csa5G64452的載體。
4. 含有權(quán)利要求2所述基因 Csa5G64452的工程菌。
5. 權(quán)利要求2所述基因 Csa5G64452在控制黃瓜無卷須性狀中的應(yīng)用。
6. -種與黃瓜卷須性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于，其位于如Seq ID No. 2所示的控 制黃瓜無卷須性狀的基因 Csa5G64452第1012bp處，此處堿基為T的黃瓜表現(xiàn)為無卷須性 狀，而此處堿基為A的黃瓜表現(xiàn)為有卷須性狀。
7. 用于檢測權(quán)利要求6所述SNP標(biāo)記的特異性引物對，其特征在于，包括正向引物F 5' -AATAATATCATTGGGATCATGTGG-3' 和反向引物 R 5' -TTGGAAGCTGGAAAATAGAAAATAT-3'。
8. -種鑒定有無卷須性狀黃瓜的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取待測黃瓜的基因組DNA ; 2) 以待測黃瓜的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求7的引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； PCR擴(kuò)增體系以20μ 1計為：10-20ng/y 1模板DNA 1 μ 1，10ρπιο1/μ 1引物F和R各 lyl，10mmol/L dNTP mix 0.4yl，0.5U/yL Taq DNA 聚合酶 0.3yl，10XPCR 反應(yīng)緩沖液 2 μ 1，余量為水； PCR反應(yīng)條件為：94°C 4分鐘；94°C 20秒，55°C 20秒，72°C 30秒，35個循環(huán)；72°C 5分 鐘； 3) 檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，具體如下： 采用dCAPS法檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：用內(nèi)切酶SspI對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并對酶切 產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，如果檢測結(jié)果僅為一條HObp大小的條帶，則待測黃 瓜在位于如Seq ID No. 2所示的控制黃瓜無卷須性狀的基因 Csa5G644520序列第1012bp處 的堿基為T，屬于無卷須性狀的黃瓜品種；檢測結(jié)果為一條117bp大小的條帶，或同時含有 140bp和117bp兩條帶，則待測黃瓜在位于如Seq ID No. 2所示的控制黃瓜無卷須性狀的基 因 Csa5G644520序列第1012bp處的堿基為A或A/T雜合，屬于有卷須性狀的黃瓜品種。
9. 含有權(quán)利要求7所述引物對的用于檢測黃瓜有無卷須性狀的試劑盒。
10. 權(quán)利要求6所述與黃瓜卷須性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在黃瓜分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及控制黃瓜無卷須性狀的基因Csa5G644520，以及一種與黃瓜卷須性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，所述SNP標(biāo)記位于如Seq ID No.2所示的黃瓜Csa5G644520基因第1012bp處，此處堿基為T的黃瓜表現(xiàn)為無卷須性狀，而此處堿基為A的黃瓜表現(xiàn)為有卷須性狀。本發(fā)明利用稀有SNP的方法和圖位克隆等方法尋找到控制黃瓜無卷須性狀的基因Csa5G644520以及與黃瓜卷須性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記。通過衍生的酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(dCAPS)的方法檢測待測黃瓜的基因型，根據(jù)基因型即可判斷黃瓜植株是否有卷須，從而加快無卷須黃瓜的育種進(jìn)程。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N1-21, C12N1-19, C12N1-15, C12N15-82, C12N15-29, A01H5-00, C12N15-11, C07K14-415
【公開號】CN104672315
【申請?zhí)枴緾N201410642693
【發(fā)明人】黃三文, 王深浩, 張忠華, 楊學(xué)勇, 邵光金, 齊建建
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2014年11月7日