控制信號的表達(dá)載體。該些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi) 重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，W指導(dǎo)mRNA合成。 表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0100] 此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，W提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氨葉酸還原酶、新霉素抗性W及綠色英光蛋 白（GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨予青霉素抗性。
[010。 包含上述的適當(dāng)DNA序列W及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可W用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，W使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0102] 宿主細(xì)胞可W是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞 如酵母；植物細(xì)胞；果禍S2或S巧的昆蟲細(xì)胞；CH0、NS0、C0S7、或293細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
[0103] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl,。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磯酸巧共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0104] 獲得的轉(zhuǎn)化子可W用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多膚。根據(jù)所用 的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)） 誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
[0105] 在上面的方法中的蛋白質(zhì)可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果 需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化蛋白。該些方法是 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。該些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀 劑處理（鹽析方法）、離也、滲透破菌、超處理、超離也、分子篩層析（凝膠過濾）、吸附層析、 離子交換層析、高效液相層析0PLC)和其它各種液相層析技術(shù)及該些方法的結(jié)合。
[0106] 表達(dá)、酶切和純化
[0107] 利用本發(fā)明的式I融合蛋白，可W高效簡便地制備高純度的LR3IGF-1。
[010引在本發(fā)明的一個具體的優(yōu)選例中，包括下列幾個方面：
[0109] W商業(yè)化載體PET3化為基礎(chǔ)，進(jìn)行了改造（改造第二連接膚），從而解決了腸激酶 非特異性酶切的問題。改造后的新質(zhì)粒命名為PET32-T。
[0110] 在LR3IGF-1編碼序列前加入腸激酶識別位點(diǎn)孤孤K的識別位點(diǎn)，保證融合蛋白在 經(jīng)過腸激酶的酶解后能夠獲得和標(biāo)準(zhǔn)LR 3IGF-1 -樣的N端殘基序列；
[01U] 將含有編碼本發(fā)明式I所示融合蛋白的編碼序列的載體（如PET32-T-LR3IGF-1) 轉(zhuǎn)入大腸桿菌（如菌株化21 0E3))，得到工程菌。
[om] 將工程菌在誘導(dǎo)劑（如IPTG)的誘導(dǎo)下表達(dá)融合蛋白（記為 TRX-6XHIS-EK-LR3IGF-1)，該融合蛋白W包涵體形式表達(dá)；
[0113] 融合表達(dá)的TRX-6XHIS-EK-LR3IGF-1的大腸桿菌經(jīng)過裂菌、包涵體溶解、金屬馨合 純化等步驟得到純化的融合蛋白；
[0114] 對融合蛋白進(jìn)行復(fù)性；
[0115] 對復(fù)性后的融合蛋白進(jìn)行透析和酶切，得到含LR3IGF-1的酶切產(chǎn)物；
[0116] 對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，從而得到分離的或純化的LR3IGF-1。
[0117] 典型地，該分離純化可包括多個步驟：
[0118] (a)離子交換，反相等層析步驟得到LR3IGF-1粗品；
[011引 化）對LR3IGF-1粗品通過反相純化，最終得到反相純度大于95%的LR3IGF-1，在 SDS-PAGE電泳上顯示為單一條帶。
[0120] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：
[0121] (a)本發(fā)明提供的制備方法產(chǎn)量高；
[0122] 化）制備的LR3IGF-1純度非常高，無分子量相近的雜質(zhì)；
[0123] (C)本發(fā)明的生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0124] (d)本發(fā)明制備的LR3IGF-1純品和市售的LR3IGF-1的分子量和生物活性完全一 致。
[0125] (e)生產(chǎn)低成本，工藝穩(wěn)定。
[0126] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，該些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆；實(shí)驗(yàn)室手冊（New York:Cold Spring Harbor L油oratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0127] 蛋白純化實(shí)驗(yàn)均按照GE Healthcare提供的技術(shù)手冊操作，所有純化填料均購自 GE Healthcare。
[0128] 實(shí)施例1表達(dá)載體PET32-T的構(gòu)建
[0129] 人工合成W下兩條引物：
[0130] 引物 R ;5'GGTACCCAGATCTGGATGATGATGATGATGGTGCATATGGCCAG3'（SEQ ID NO. :8)
[0131] 引物 F ;5'CCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAA3'（SEQ ID NO. :9)
[0132] 另外，從上海生工生物工程有限公司購買兩條通用引物（T7Promoter和 TTTerminator)。
[0133] 分別W引物R和T7Promoter為引物，W質(zhì)粒祀T3化（購自Novagen公司）為模板 W及引物F和T7Terminator為引物，PET3化為模板做PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為；95°C變性5分 鐘，然后W 95 °C變性30砂，62 °C退火30砂并68度延伸1分鐘進(jìn)行30個循環(huán)，最后W 68 °C 延伸10分鐘并降溫至4°C。
[0134] 瓊脂糖凝膠電泳上述PCR產(chǎn)物，回收一個約450bp和約20化P的片段，W引物 T7Promoter和T7Terminator為引物，兩個回收產(chǎn)物分別取lul混合作為PCR的模板做PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為；95°C變性5分鐘，然后W 95C變性30砂，62C退火30砂并68度延伸1 分鐘進(jìn)行30個循環(huán)，最后W 68度延伸10分鐘并降溫至4C。
[01巧]瓊脂糖凝膠電泳上述PCR產(chǎn)物，回收一個約65化P的片段，用甜a I和Hindlll雙 酶切該片段，并與經(jīng)過該兩個內(nèi)切酶酶切的祀T3化（購自Novagen公司）用T4DNA連接酶 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌D冊a中。
[0136] 挑出陽性克隆，抽出其中的質(zhì)粒，經(jīng)過測序驗(yàn)證無誤后命名為質(zhì)粒祀T32-T。
[0137] 實(shí)施例2編碼本發(fā)明LR3IGF-1基因序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)和全基因合成
[0138] 通過軟件分析，找出天然IGF-1中存在稀有密碼子W及不穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，通過 大腸桿菌偏愛密碼子數(shù)據(jù)W及同義密碼子的置換，最終得到優(yōu)化的lr 3igf-i編碼核酸序列 沈Q ID NO. :5。
[0139] 在優(yōu)化后的序列N端加入限制性內(nèi)切酶化n I位點(diǎn)W及腸激酶識別序列D孤DK 的編碼序列，在C端加入限制性內(nèi)切酶化nd III位點(diǎn)，設(shè)計(jì)得到的一核巧酸序列SEQ ID NO. : 10,其中編碼區(qū)位于第22-270位。
[0140] GGTACCGACGACGACGACAAGATGTTTCCGGCGATGCCGCTGAGCAGCCTGTTTGTGAACGGCCCACGT ACCCTGTGTGGTGCTGAACTGGTAGATGCTCTGCAGTTCGTGTGCGGTGACCGTGGCTTCTACTTTAACAAGCCGAC TGGTTACGGTTCTTCTTCCCGCCGTGCCCCGCAGACCGGCATCGTTGATGAATGCTGCTTCCGTAGCTGCGACCTGC GCCGTCTGGAGATGTATTGTGCGCCGCTGAAACCGGCGAAATCTGCATAAGCTT (沈Q ID NO. :10)
[014。 委巧上海生工生物工程有限公司全基因合成該SEQ ID NO. : 10序列，通過上述酶 切位點(diǎn)克隆入市售的PUC19載體（購自上海生工生物工程有限公司）中，經(jīng)測序驗(yàn)證后命 名為 pUC19-LR3IGF-l (優(yōu)化）。
[014引同時基于LR3IGF-1的天然序列（SEQ ID NO. :4)也按上述方案加入腸激酶識別位 點(diǎn)W及限制性內(nèi)切酶化n I和Hind III位點(diǎn)，全基因合成該序列，并同樣克隆到PUC19載 體中，經(jīng)測序驗(yàn)證后命名為pUC19-LR3IGF-1 (天然）。
[014引實(shí)施例3表達(dá)LR3IGF-1的載體構(gòu)建
[0144] 在本實(shí)施例中，采用優(yōu)化的表達(dá)載體為祀T32-T(為實(shí)施例1中所得到的載體）， 從而使得融合蛋白中的第二連接膚為優(yōu)選的PDLGT。
[0145] 方法；將祀T32-T和pUC19-LR3IGF-l (優(yōu)化）用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Hindlll 做雙酶切，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收，再用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化到大腸桿菌D冊a中。挑出陽性克隆，抽出其中的質(zhì)粒，經(jīng)過測序驗(yàn)證無誤后命名為 pET32-T-LR3iGF-1。
[0146] 重復(fù)上述步驟，不同點(diǎn)在于用pUC19-LR3IGF-l (天然）替換pUC19-LR3IGF-l (優(yōu) 化），從而構(gòu)建得到祀T32-T-LR3IGF-1 (天然）。
[0147] 實(shí)施例4表達(dá)L