一株樺褐孔菌qd04及其轉(zhuǎn)化虎杖生成白藜蘆醇、三萜皂苷和多糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株禪褐孔菌 孤04及其轉(zhuǎn)化虎杖生成白黎蘆醇、H聰皂巧和多糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白黎蘆醇（3,4'，5- H羥基-反式-二苯己帰）是一種非黃麗類多酷化合物，存在 于虎杖、葡萄、花生等70余種植物中，是植物處于逆境下產(chǎn)生的一種植物抗毒素。研究表明 白黎蘆醇具有抗癌、抗氧化、保護(hù)也血管系統(tǒng)、清除自由基和延緩衰老等功效。
[0003] 白黎蘆醇的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成和從天然植物中提取。化學(xué)合成法成本高，污染 環(huán)境，所W目前白黎蘆醇的生產(chǎn)主要是從植物中提取。然而，植物中的白黎蘆醇含量特別 低，其中在虎杖中含量最高，但也僅達(dá)到0. 43% (漢中地區(qū))，該就使得其分離純化成本偏高。 而白黎蘆醇類似物白黎蘆醇巧在植物中的含量遠(yuǎn)高于白黎蘆醇。在虎杖中，白黎蘆醇巧的 含量可達(dá)到2. 5% (漢中地區(qū)）。如果將白黎蘆醇巧轉(zhuǎn)化為白黎蘆醇，白黎蘆醇的產(chǎn)率可大幅 度提局。
[0004] 傳統(tǒng)上，巧元的獲得是通過水解相應(yīng)的糖巧來實現(xiàn)的。但水解反應(yīng)需要在高溫高 壓下由酸或堿催化來完成，對設(shè)備要求高，且對環(huán)境造成污染。相比之下，生物轉(zhuǎn)化法具有 條件溫和，過程簡單，污染小等優(yōu)點，已經(jīng)成為藥物修飾的重要手段。
[0005] 將白黎蘆醇巧轉(zhuǎn)化為白黎蘆醇主要是通過酶法轉(zhuǎn)化和微生物轉(zhuǎn)化實現(xiàn)的。例如， 在粉末狀虎杖原料中加入復(fù)合酶恒溫酶解反應(yīng)48~72小時，或者在虎杖提取液中加入纖維 素酶進(jìn)行水解。酶法轉(zhuǎn)化雖然取得了一定的效果，但是酶價格昂貴，限制了該些方法的推廣 使用。一些研究者利用微生物轉(zhuǎn)化虎杖的白黎蘆醇巧粗提物，雖然白黎蘆醇轉(zhuǎn)化率較高(超 過95%)，但提取白黎蘆醇巧增加了操作步驟且需要大量有機溶劑。另有研究將浸潤后的虎 杖置于溫度為20~5(TC的容器內(nèi)自然發(fā)酵24~96小時或者在虎杖中加入專用微生物進(jìn)行轉(zhuǎn) 化提高了白黎蘆醇的產(chǎn)率。但自然發(fā)酵過程中的菌群未知，條件難W控制，且空氣中的霉菌 有可能產(chǎn)生有毒物質(zhì)；專用微生物轉(zhuǎn)化法中所用微生物未公開，無法驗證和重復(fù)，其實用性 受到極大限制。再者，已報道的高效轉(zhuǎn)化白黎蘆醇巧的微生物菌種主要是霉菌，該樣不僅得 到的白黎蘆醇產(chǎn)品可能存在安全隱患，發(fā)酵過程中還產(chǎn)生大量菌絲體和藥渣，造成資源浪 費和環(huán)境污染。
[0006] 藥用真菌中的白腐菌能夠同時分泌纖維素酶和木質(zhì)素降解酶，比霉菌更適合水解 天然木質(zhì)纖維素。研究表明，禪褐孔菌對液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中的甘藏渣、稻桿、麥桿和花 生殼的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素成分均有較好的降解效果。同時，禪褐孔菌主要活性成分 H聰皂巧在抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化和調(diào)節(jié)也血管系統(tǒng)等方面均呈現(xiàn)較好的生物活 性；禪褐孔菌多糖具有降血糖及血脂、抗病毒及腫瘤、抗氧化及衰老、抗炎及抗凝血、增強免 疫力和止痛等功效。另外，發(fā)酵產(chǎn)物禪褐孔菌菌絲體含有豐富的人體必需氨基酸，具有較高 的營養(yǎng)價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一株禪褐孔菌孤04及其轉(zhuǎn)化虎杖生成白黎蘆醇、H聰皂巧 和多糖的方法，所述禪褐孔菌孤〇4(//7(9/7(9加S 于中國典型培養(yǎng)物保藏中也保藏， 編號為CCTCC M 2015036, W下簡稱禪褐孔菌孤04。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是禪褐孔菌孤04利用虎杖作為主要碳源，將植物中的白黎蘆 醇巧轉(zhuǎn)化為白黎蘆醇，合成自身活性成分多糖和H聰皂巧，大大提高了白黎蘆醇的收率。
[0009] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案予W實現(xiàn)： 本發(fā)明提供了一株禪褐孔菌孤04,其分類命名為禪褐孔菌/化wotos oW切W/S，保藏 于中國典型培養(yǎng)物保藏中也，其保藏編號為CCTCC M 2015036。
[0010] 所述孤04的菌落呈圓形，初始時為絨毛狀，后變?yōu)槊扌鯛睿哂型草喖y；菌絲無 色透明，具有隔膜，樹狀分支較多，呈現(xiàn)交叉網(wǎng)狀，菌絲前端較齊短。
[0011] 本發(fā)明還提供了所述的禪褐孔菌孤04轉(zhuǎn)化虎杖生成白黎蘆醇、H聰皂巧和多糖 的方法，它包括W下步驟： 1) 種子培養(yǎng)：將所述禪褐孔菌孤04接種到種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得種子培養(yǎng)液，搖床 轉(zhuǎn)速為100~2(K)巧m，溫度為20~3(TC，培養(yǎng)時間為4~6 d ; 2) 發(fā)酵培養(yǎng)；將所述種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為按照體積比5%~15%， 搖床轉(zhuǎn)速為100~2(K)巧m，溫度20~3(TC，培養(yǎng)時間為8~12 d，發(fā)酵產(chǎn)物中含有所述白黎蘆 醇、H聰皂巧和多糖。
[0012] 對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)；所述種子培養(yǎng)基的組分包括葡萄糖1~3%、蛋白腺 0. 5~2. 0%、KH2PO4 0. 2~0. 4%、M拆〇4 ? 7&0 0. 1~0. 3%和款皮0. 5~2%，按質(zhì)量體積百分比計。
[0013] 對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源、氮源、無機鹽和誘導(dǎo) 物，所述碳源包括添加量占培養(yǎng)基質(zhì)量體積比為0. 5~8. 0%的虎杖；所述氮源的添加量占培 養(yǎng)基質(zhì)量體積比為0. 5~2. 5%，所述誘導(dǎo)物為占培養(yǎng)基質(zhì)量體積比為0. 5~4. 0%的款皮。
[0014] 對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)；所述碳源還包括添加量占培養(yǎng)基質(zhì)量體積比為 0. 5~2. 0%的補充碳源，所述補充碳源為麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、藏糖或玉米粉中的一 種或幾種。
[0015] 對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)；所述氮源為蛋白腺、黃豆粉、豆稍、牛肉膏、酵母膏 或（NH4)2S0沖的一種或幾種。
[0016] 對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)；所述無機鹽為KH2PO4和M拆〇4 ? 7&0,其添加量分 別占培養(yǎng)基質(zhì)量體積比為0. 3%和0. 15〇/〇。
[0017] 對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)；所述方法還包括步驟3)發(fā)酵罐培養(yǎng)；在發(fā)酵罐中 進(jìn)行，接種量為按照體積比5%~15%，轉(zhuǎn)速為150~35化pm,溫度為20~3(TC，發(fā)酵過程中 通入空氣量為0. 8~1. 5vvm，發(fā)酵時間為8~lO