一種從動(dòng)物組織中獲得原代細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于現(xiàn)代生物技術(shù)之細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從動(dòng)物組織中獲得原代細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]原代培養(yǎng)指的是通過(guò)組織塊直接長(zhǎng)出的細(xì)胞或用酶或機(jī)械方法將組織分散成的單個(gè)細(xì)胞的方法，這些細(xì)胞和組織剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，多呈二倍體核型，與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大，在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)。特別是在細(xì)胞培養(yǎng)會(huì)合時(shí)，原代培養(yǎng)的某些特殊功能表達(dá)尤為強(qiáng)烈。在這樣的培養(yǎng)階段能更好地顯示與親體組織緊密結(jié)合的形態(tài)學(xué)特征。原代細(xì)胞是研宄生物體細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、繁殖、分化很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象；還可直接服務(wù)于臨床實(shí)踐，例如，用從手術(shù)中切除的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，然后用該培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行抗癌藥物的篩選，根據(jù)腫瘤細(xì)胞對(duì)加入的化療藥物的敏感性來(lái)幫助選擇最有效的化療方案，有可能起到增強(qiáng)療效、降低副作用的作用；另外，原代培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系(株)必經(jīng)的階段。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生物、醫(yī)學(xué)科學(xué)研宄中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。
[0003]機(jī)體是由千千萬(wàn)萬(wàn)個(gè)形態(tài)結(jié)構(gòu)、遺傳物質(zhì)不同的細(xì)胞構(gòu)成，并且細(xì)胞與細(xì)胞之間存在相互調(diào)節(jié)、彼此影響，在機(jī)體內(nèi)進(jìn)行某一類細(xì)胞的研宄是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)轶w內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，條件不容易控制，而建系的癌細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中往往失去了很多原有的特征，大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，不能完全正確的反應(yīng)體內(nèi)狀態(tài)；而且有些部位的細(xì)胞又不能夠形成穩(wěn)定的細(xì)胞株，如微小血管的平滑肌細(xì)胞。因此我們常常需要通過(guò)原代培養(yǎng)技術(shù)從組織中培養(yǎng)出原代細(xì)胞來(lái)進(jìn)行研宄.
[0004]目前，最常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上，加入培養(yǎng)基后進(jìn)行培養(yǎng)。分散細(xì)胞培養(yǎng)則是將組織塊用機(jī)械法或化學(xué)法使細(xì)胞分散。如欲從胎兒或新生兒的組織分離到活性最好的游離細(xì)胞，經(jīng)典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和膠原酶)消化細(xì)胞間的結(jié)合物，或用金屬離子螯合劑(如EDTA)除去細(xì)胞互相粘著所依賴的Ca2+，再經(jīng)機(jī)械輕度振蕩，使之成為單細(xì)胞。經(jīng)我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分散細(xì)胞培養(yǎng)法步驟繁瑣，對(duì)細(xì)胞的影響較大，分散程度不易掌握，在打散細(xì)胞連接時(shí)會(huì)嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜上表達(dá)的蛋白成分，導(dǎo)致蛋白組織學(xué)的研宄出現(xiàn)假陰性結(jié)果，另外，細(xì)胞得率低，活力下降，生長(zhǎng)緩慢，難以成功傳代。而組織塊培養(yǎng)法避免了該弊端，具有成功率高、所需組織量少、溫和、耗時(shí)短、經(jīng)濟(jì)、避免外源性蛋白污染等優(yōu)點(diǎn)(PriyaN，Sarcar S，Majumdar AS，et at.Explant culture:a simple, reproducible,efficientand economic technique for isolat1n of mesenchymal stromal cells from humanadipose tissue and lipoaspirate[J].J Tissue Engi Regen Med，2012，July 27:1-9.)，對(duì)細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)損傷比較小，可用于后續(xù)細(xì)胞表面分子篩選、細(xì)胞藥物敏感試驗(yàn)、細(xì)胞的分選與鑒定等研宄。
[0005]但是，目前組織塊培養(yǎng)法需要組織塊貼壁，細(xì)胞才有可能爬出，這是本方法最大的難點(diǎn)，組織塊貼壁不牢易漂浮，爬出的細(xì)胞數(shù)就少，現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的提高組織塊貼壁率的培養(yǎng)方法也不統(tǒng)一，大多是少加培養(yǎng)液，當(dāng)然還有將組織塊上方放蓋玻片，或者在培養(yǎng)皿/孔底涂胎牛血清或鋪上細(xì)胞外基質(zhì)，或者在培養(yǎng)皿/孔底面先行劃痕，甚至劃痕、涂胎牛血清兩法并用等方法(Elliget, K.A.and Lecher, J.F.Normal humanbronchial epithelial cell cultures.1n Freshney, R.1.Culture of epithelial cell.New York, ffiley-Liss, 1992, 181-196.Nicosia, R.F.and Ottinetti, A.Modulat1n ofmicrovascular growth and morphogenesis by reconstituted basement membranegel in three-dimens1nal cultures of rat aorta:A comparative study ofang1genesis in Matrigel, collgen, fibrin, and plasma clot.1n Vitro Cell Dev.B1l.1990，26:119-128.)，但這些方法要么操作難度大易污染，要么組織貼壁成功率還是不高，對(duì)于不同來(lái)源的組織所用的培養(yǎng)方法各異，這些培養(yǎng)技術(shù)不僅對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)要求很高，而且不容易掌握。
[0006]目前尚無(wú)一種可以應(yīng)用于多種來(lái)源的組織培養(yǎng)原代細(xì)胞，方法簡(jiǎn)單易操作，培養(yǎng)穩(wěn)定，重復(fù)性高，初學(xué)者易掌握，成功率極高，得到的細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定、活性好、數(shù)量足，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)；且縮短試驗(yàn)周期，降低了實(shí)驗(yàn)成本，提高了實(shí)驗(yàn)效率的原代細(xì)胞組織塊培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種原代細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)方法，具體是從動(dòng)物組織中獲得原代細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)方法，可通用于絕大多數(shù)不同來(lái)源的動(dòng)物組織進(jìn)行原代細(xì)胞的培養(yǎng)，而且該培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單易掌握，成功率高，獲得的原代細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定、活性好、數(shù)量足，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0009]本發(fā)明擬在解決組織塊培養(yǎng)法存在的技術(shù)難點(diǎn)一即組織塊貼壁不牢易漂浮，爬出的細(xì)胞數(shù)就較少，如何提高組織塊貼壁率是獲得活性好、數(shù)量足原代細(xì)胞的技術(shù)關(guān)鍵。本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)，采用胎牛血清輔助組織貼壁的方法，可用于不同來(lái)源的組織培養(yǎng)原代細(xì)胞，本發(fā)明的主要技術(shù)方案是將所需要培養(yǎng)的組織收集在冰預(yù)冷的含5X雙抗的胎牛血清中，洗去組織表面血污，放在胎牛血清里用眼科剪剪碎，均勻鋪在皿/孔上，倒置放于孵箱一定時(shí)間，利用胎牛血清使組織黏貼在皿/孔上，沿皿/孔邊緩慢加入適量的相應(yīng)培養(yǎng)液，輕輕挪入孵箱中靜置培養(yǎng)。
[0010]本發(fā)明提供了一種原代細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0011]j)將組織處理器械(剪刀和鑷子，剪刀優(yōu)選眼科剪，鑷子優(yōu)選彎頭鑷)浸泡到75%乙醇放入超凈臺(tái)中，紫外滅菌30min ；
[0012]k)將組織處理器械從75%乙醇中取出放超凈臺(tái)里晾干；
[0013]I)在裝有胎牛血清的容器中加入5 X雙抗(5倍的青霉素-鏈霉素雙抗)，插入冰里；所述的容器優(yōu)選為離心管，所述的離心管可以是50ml的；胎牛血清的用量以可以沒(méi)入組織為宜；
[0014]m)培養(yǎng)皿/孔中滴入適量胎牛血清；
[0015]η)取組織放入步驟c)的含抗生素的胎牛血清中，吹打組織，以去除表面血污；再將組織放入步驟d)培養(yǎng)皿/孔中的胎牛血清中；
[0016]ο)反復(fù)剪切胎牛血清中的組織，將組織剪成或切成0.5-2mm3最優(yōu)為Imm 3大小的組織塊，將組織塊均勻地鋪在培養(yǎng)皿/孔里，每個(gè)組織塊間距為0.2cm-0.5cm ;
[0017]p)倒置在孵箱中l(wèi)_2h (與每種細(xì)胞對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)條件相同)，沿培養(yǎng)皿/孔邊緩慢加入適量的相應(yīng)培養(yǎng)液，勿使組織塊漂起，輕輕挪入孵箱中培養(yǎng)；
[0018]q) 3-6天換液一次，換液時(shí)輕輕吸掉原液，加入新的培養(yǎng)液；
[0019]r)待原代細(xì)胞從組織塊爬出后，用吸管吸培養(yǎng)液輕輕吹打組織塊將其吹掉，換上新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，直至長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿/孔底，進(jìn)行傳代或進(jìn)一步篩選。
[0020]本發(fā)明在步驟i)之后，還包括以下步驟:
[0021]j)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與鑒定:鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞儀等方法檢測(cè)每種細(xì)胞相應(yīng)的特異性標(biāo)記物。
[0022]本發(fā)明步驟d)適量的胎牛血清是指待組織均勻鋪滿培養(yǎng)皿/孔上后，倒置培養(yǎng)時(shí)胎牛血清不向下流即可。
[0023]本發(fā)明步驟e)是為了使組織處于盡量無(wú)菌、低溫的環(huán)境，細(xì)胞代謝慢，且營(yíng)養(yǎng)豐富，最大可能地保持細(xì)胞活性，將取得的組織盡快放入冰預(yù)冷的含5X雙抗的胎牛血清中，洗去組織表面血污。
[0024]本發(fā)明步驟g)加入適量的相應(yīng)培養(yǎng)液，所述的相應(yīng)培養(yǎng)液為不同來(lái)源的組織(應(yīng)該是根據(jù)原代細(xì)胞來(lái)確定的)常規(guī)培養(yǎng)液；例如小鼠原代肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的高糖DMEM ;例如小鼠原代胰腺導(dǎo)管細(xì)胞，培養(yǎng)液為含20%胎牛血清和2X雙抗的高糖DMEM ;例如人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)液為EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。
[0025]本發(fā)明步驟i)吹掉組織塊的時(shí)間首先要根據(jù)每種細(xì)胞爬出組織塊的時(shí)間(文獻(xiàn)報(bào)道或?qū)嶒?yàn)經(jīng)驗(yàn))而定，其次是組織塊周圍長(zhǎng)滿細(xì)胞即可吹掉組織塊。
[0026]本發(fā)明的技術(shù)關(guān)鍵在于步驟e)、f)、g)，特別是組織要放在胎牛血清里剪碎，均勻鋪在培養(yǎng)皿/孔上，即利用胎牛血清使組織黏貼在培養(yǎng)皿/孔上，又能保持細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)；另外要沿培養(yǎng)皿/孔邊緩慢加入適量的培養(yǎng)液，勿使組織塊漂起。
[0027]本發(fā)明的一種從動(dòng)物組織中獲得原代細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)方法，所述的動(dòng)物組織包括不同種屬的正常組織和癌組織。
[0028]所述的不同種屬包括小鼠、大鼠、豬、兔、狗、羊、人等。
[0029]所述的小鼠組織包括小鼠肺組織、小鼠胰腺組織等。
[0030]所述的人正常組織包括人牙髓組織、人牙周膜組織、人臍靜脈組織等。
[0031]所述的人癌組織包括人腦膠質(zhì)瘤組織、人前列腺癌原發(fā)灶組織培養(yǎng)、人前列腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織、人血管瘤組織。
[0032]所述的原代細(xì)胞包括通過(guò)各種動(dòng)物組織獲得小鼠原代肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞、小鼠原代胰腺導(dǎo)管細(xì)胞、小鼠原代胰腺星狀細(xì)胞、人原代牙髓干細(xì)胞、人原代牙周膜細(xì)胞、人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人原代腦膠