型膠原酶的濃度是2g/L。由于主動(dòng)脈翻轉(zhuǎn)和打結(jié)，主動(dòng)脈外膜無(wú)法被膠原酶消化。
[0047]4、在37°C溫箱中培育60分鐘后，將被消化的主動(dòng)脈放入培育皿中，其中盛有含無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，然后將主動(dòng)脈兩端結(jié)點(diǎn)剪掉以便其成為中空管狀樣。沿縱向剪開(kāi)中空主動(dòng)脈使管狀樣主動(dòng)脈打開(kāi)并分割成4-5小塊主動(dòng)脈薄片備用，主動(dòng)脈薄片大小通常是2cm*4cm。這些被消化的主動(dòng)脈薄片非常適用于初級(jí)貼壁培養(yǎng)。
[0048]5、將一塊主動(dòng)脈薄片平鋪在六孔板上，六孔板中每孔加入800ul含20%血清、50ug/ml肝素的DMEM/F12培養(yǎng)液以便僅僅使主動(dòng)脈內(nèi)膜沉浸在培養(yǎng)液中，而不是包括外膜的整個(gè)主動(dòng)脈沉浸其中。保持主動(dòng)脈薄片始終貼壁，并且每隔48小時(shí)更換培養(yǎng)液一次，同時(shí)第一次更換培養(yǎng)液時(shí)需防止移動(dòng)主動(dòng)脈薄片。
[0049]6、在第三天或者第四天，主動(dòng)脈薄片周?chē)梢?jiàn)少數(shù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。如果血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯可見(jiàn)，可移除主動(dòng)脈薄片，移除主動(dòng)脈薄片的時(shí)間不晚于120個(gè)小時(shí)。然后每天更換培養(yǎng)液，3ml/孔。在第九天，我們將獲得大量的血管內(nèi)皮細(xì)胞，第十四天可以用于細(xì)胞傳代。通常分離的主動(dòng)脈可以分割成4-5塊主動(dòng)脈薄片，每塊主動(dòng)脈薄片將在第九天獲得大量血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0050]實(shí)施效果例I生長(zhǎng)情況及形態(tài)學(xué)觀察:
[0051]原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第三天后*100鏡下觀察，主動(dòng)脈薄片邊緣可見(jiàn)少許零星分布的扁平、梭形或多邊形細(xì)胞，見(jiàn)圖1。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第三天后*200鏡下觀察，見(jiàn)圖2。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第三天后*400鏡下觀察，見(jiàn)圖3。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第四天后*100鏡下觀察，明顯可見(jiàn)主動(dòng)脈薄片邊緣扁平、梭形或多邊形細(xì)胞數(shù)量增加，且部分細(xì)胞向外部迀移，見(jiàn)圖4。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第四天后*200鏡下觀察，見(jiàn)圖5。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第四天后*400鏡下觀察，見(jiàn)圖6。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第五天后*100鏡下觀察，移除主動(dòng)脈薄片，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量成倍增加，形態(tài)多成梭形或多邊形，大小均勻，見(jiàn)圖7。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第五天后*200鏡下觀察，見(jiàn)圖8。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第五天后*400鏡下觀察，見(jiàn)圖9。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第七天后*100鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量劇增，說(shuō)明細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，見(jiàn)圖10。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第七天后*200鏡下觀察，見(jiàn)圖11。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第七天后*100鏡下觀察，見(jiàn)圖12。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第九天后*100鏡下觀察，細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，增殖速率加快，見(jiàn)圖13。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第九天后*400鏡下觀察，見(jiàn)圖15。原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第十四天后*100鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)融合形成單層后，呈典型的鵝卵石或鋪路石鑲嵌狀排列生長(zhǎng)，并且有接觸抑制現(xiàn)象，此時(shí)可傳代培養(yǎng)見(jiàn)圖16。
[0052]實(shí)施效果例2⑶31免疫細(xì)胞分析:
[0053]⑶31抗體免疫細(xì)胞化學(xué)(I) SABC顯色，可見(jiàn)胞漿中淡黃棕色陽(yáng)性細(xì)胞(見(jiàn)圖17)；
(2)FITC熒光二抗分析，可見(jiàn)胞漿中綠色熒光強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞(見(jiàn)圖18)。
[0054]實(shí)施效果例3血管內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn):
[0055]從大鼠胸主動(dòng)脈分離的原代內(nèi)皮細(xì)胞及傳代培養(yǎng)細(xì)胞，在Matrigel基質(zhì)膠中培養(yǎng)2h后，均可見(jiàn)形成部分管狀結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖19);至培養(yǎng)6h可見(jiàn)形成完整的血管樣小管(見(jiàn)圖 20) ο
[0056]實(shí)施效果例4血管內(nèi)皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線
[0057]取大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞原代、第二代和第三代，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2*105/ml。24孔板每孔加入細(xì)胞懸液lOOul，含20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液900ul，于37°C、5% CO2培養(yǎng)。第2天開(kāi)始，每天4孔連續(xù)計(jì)數(shù)7d，分別繪制1-3代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了三代傳代培養(yǎng)，不同代次細(xì)胞形態(tài)上無(wú)變化，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖21。細(xì)胞于分瓶后2天至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在相同培養(yǎng)時(shí)間不同代次細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(P > 0.05)。
[0058]以上對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明申請(qǐng)范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專(zhuān)利涵蓋范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)取大鼠主動(dòng)脈，用無(wú)菌PBS液進(jìn)行沖洗，然后將其沉浸在含肝素的DMEM/F12培養(yǎng)液中以備用； (2)利用無(wú)菌針線將主動(dòng)脈內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)出來(lái)，并在兩端打結(jié)； (3)將翻轉(zhuǎn)后的主動(dòng)脈放在膠原酶中消化； (4)在37°C溫箱中培育后，將被消化的主動(dòng)脈放入無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，將主動(dòng)脈兩端結(jié)點(diǎn)剪去使其成為中空管狀樣，沿縱向剪開(kāi)并將其分割成小塊的主動(dòng)脈薄片備用； (5)將主動(dòng)脈薄片進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，所述主動(dòng)脈薄片的主動(dòng)脈內(nèi)膜部分浸入含肝素和血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，每隔48h更換一次培養(yǎng)液； (6)第3-5天，移除主動(dòng)脈薄片，之后每天更換培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液與步驟(5)相同，第9天即可獲得大量的血管內(nèi)皮細(xì)胞，第14天后可用于細(xì)胞傳代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟(I)中的DMEM/F12培養(yǎng)液含1000U/ml肝素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟(3)中膠原酶為II型膠原酶或I型膠原酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于:所述II型膠原酶或I型膠原酶的濃度為2g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟(4)中37°C溫箱中培育60分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟(4)的主動(dòng)脈可分割為4 一 5塊主動(dòng)脈薄片，所述主動(dòng)脈薄片的大小為2cm*4cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟(5)的DMEM/F12培養(yǎng)液中血清含量為20%、肝素含量為50ug/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1一 7任一項(xiàng)所述的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(2)中利用無(wú)菌針線將主動(dòng)脈內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)出來(lái)，并在兩端打結(jié)的具體方法為:用一根無(wú)菌細(xì)針系上4-0尼龍線，將無(wú)菌針線穿過(guò)主動(dòng)脈內(nèi)腔，穿過(guò)后將無(wú)菌針剪下，利用尼龍線在主動(dòng)脈一末端打結(jié)固定；利用眼科鑷固定尼龍線未打結(jié)的一端，然后利用另一個(gè)眼科鑷將分離的主動(dòng)脈沿打結(jié)端翻轉(zhuǎn)，輕輕的拉扯主動(dòng)脈外膜直到整個(gè)主動(dòng)脈是主動(dòng)脈內(nèi)膜朝外主動(dòng)脈外膜朝內(nèi)，將翻轉(zhuǎn)后的主動(dòng)脈未打結(jié)的一端打結(jié)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1一 7任一項(xiàng)所述的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(5)中貼壁培養(yǎng)的方式為，將主動(dòng)脈薄片平鋪在六孔板上，六孔板中每孔加入SOOul含肝素和血清的DMEM/F12培養(yǎng)液以便僅僅使主動(dòng)脈內(nèi)膜沉浸在培養(yǎng)液中。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(6)中移除主動(dòng)脈薄片后，每天更換培養(yǎng)液，加入量為3ml/孔。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，包括取大鼠主動(dòng)脈，用無(wú)菌PBS液進(jìn)行沖洗，將其沉浸在含肝素的DMEM/F12培養(yǎng)液中；利用無(wú)菌針線將主動(dòng)脈內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)出來(lái)，并在兩端打結(jié)；將翻轉(zhuǎn)后的主動(dòng)脈放在膠原酶中消化；在37℃溫箱中培育后，將被消化的主動(dòng)脈放入無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，并將其分割成小塊的主動(dòng)脈薄片；將主動(dòng)脈薄片進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，主動(dòng)脈薄片的主動(dòng)脈內(nèi)膜部分浸入含肝素和血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，每隔48h更換一次培養(yǎng)液；第3-5天，移除主動(dòng)脈薄片，之后每天更換培養(yǎng)液，第9天即可獲得大量的血管內(nèi)皮細(xì)胞，第14天后可用于細(xì)胞傳代。
【IPC分類(lèi)】C12N5-071
【公開(kāi)號(hào)】CN104673744
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510103424
【發(fā)明人】王俊力
【申請(qǐng)人】王俊力
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年3月10日