一種自然殺傷細(xì)胞擴(kuò)增的方法和一種培養(yǎng)基組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地，設(shè)及一種自然殺傷細(xì)胞擴(kuò)增的方法和一 種培養(yǎng)基組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然殺傷細(xì)胞（化化ral killer cell, NK細(xì)胞）是機(jī)體抵抗惡性腫瘤和病 毒感染的重要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。NK細(xì)胞可W分泌穿孔素、NK細(xì)胞毒因子（NK cytotoxic factor, NKC巧和腫瘤壞死因子（TNF)。其中，穿孔素是一種由NK細(xì)胞胞漿顆粒釋放的殺傷 祀細(xì)胞的介質(zhì)。從NK細(xì)胞胞漿顆粒中純化的穿孔素在體外能溶解多種腫瘤細(xì)胞，抗穿孔素 抗體可抑制殺傷活性。IL-2可提高穿孔素基因的轉(zhuǎn)錄。IL-6可W促進(jìn)IL-2對(duì)穿孔素基因 轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)作用。絲氨酸醋酶可能有活化穿孔素的作用。其中，NKCF與祀細(xì)胞結(jié)合后可選 擇性殺傷和裂解祀細(xì)胞。其中，TNF通過改變祀細(xì)胞溶酶體的穩(wěn)定性，導(dǎo)致多種水解酶外漏， 還能影響細(xì)胞膜磯脂代謝，還能改變祀細(xì)胞糖代謝使組織中抑降低，還能活化祀細(xì)胞核酸 內(nèi)切酶，降解基因組DNA從而引起程序性細(xì)胞死亡等機(jī)理殺傷祀細(xì)胞；TNF引起細(xì)胞死亡過 程要明顯慢于穿孔素溶解細(xì)胞的作用過程。
[0003] NK細(xì)胞確切的來源還不十分清楚，一般認(rèn)為直接從骨髓中衍生，其發(fā)育成熟依賴 于骨髓的微環(huán)境。小鼠和人的體外實(shí)驗(yàn)表明，胸腺細(xì)胞在體外IL-2等細(xì)胞因子存在條件下 培養(yǎng)也可誘導(dǎo)出NK細(xì)胞。小鼠脾臟在體內(nèi)IL-3誘導(dǎo)下可促進(jìn)NK細(xì)胞的分化。NK細(xì)胞主 要分布于外周血中，占外周血單個(gè)核細(xì)胞的5-10%，淋己結(jié)和骨髓中也有NK細(xì)胞，但水平 較外周血低。
[0004] 擴(kuò)增自然殺傷細(xì)胞能夠使得針對(duì)自然殺傷細(xì)胞的研究更加方便，并有利于獲得穿 孔素、NK細(xì)胞毒因子和腫瘤壞死因子。目前對(duì)自然殺傷細(xì)胞擴(kuò)增的方法包括抗體篩選自然 殺傷細(xì)胞，聯(lián)合各種有效的細(xì)胞因子相互組合擴(kuò)增自然殺傷細(xì)胞W及通過表達(dá)細(xì)胞因子的 飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)等。但該些方法在培養(yǎng)過程中對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)人員的操作水平要求高，擴(kuò)增、培 養(yǎng)成本昂貴，培養(yǎng)體系不穩(wěn)定，培養(yǎng)時(shí)需要培養(yǎng)擴(kuò)增出的具有細(xì)胞毒作用的CD3-CD56+效應(yīng) 細(xì)胞數(shù)占比低。
[0005] CN102154207A公開了利用CD8-IL21-CD137復(fù)合方法擴(kuò)增激活淋己細(xì)胞（包括 NK細(xì)胞）的方法，該方法包括；在含有所述淋己細(xì)胞的培養(yǎng)液中，將表達(dá)CD8-IL21-CD137 復(fù)合物的宿主細(xì)胞W及白介素2共同培養(yǎng)7天。CN102428173A公開了一種NK細(xì)胞培養(yǎng) 的方法，該方法包括：利用滅活的K562腫瘤細(xì)胞飼養(yǎng)NK細(xì)胞W提高NK細(xì)胞的殺傷能力。 CN103232973A公開一種通過K562腫瘤細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法，其中，K562 腫瘤細(xì)胞含CD8 a、IL21、CD14、CD19、CD86和CD137的表達(dá)載體。
[0006] 因此，現(xiàn)有的對(duì)自然殺傷細(xì)胞擴(kuò)增的方法需要與飼養(yǎng)其它細(xì)胞的共培養(yǎng)，并且需 要發(fā)費(fèi)較長時(shí)間通過分子克隆手段構(gòu)建飼養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞因子表達(dá)體系，培養(yǎng)成本高，擴(kuò)增 步驟繁瑣，難W符合GMP標(biāo)準(zhǔn)，可重復(fù)性及穩(wěn)定性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有的對(duì)自然殺傷細(xì)胞擴(kuò)增的方法需要與其它細(xì)胞的共培 養(yǎng)的缺陷，提供一種單獨(dú)培養(yǎng)且擴(kuò)增效率較高的自然殺傷細(xì)胞擴(kuò)增的方法。
[000引本發(fā)明的發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)使用添加了特定細(xì)胞因子和特定抗體的培養(yǎng)基 對(duì)自然殺傷細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，能夠在單獨(dú)培養(yǎng)的條件下取得較高的自然殺傷細(xì)胞的擴(kuò)增效 率，由此得到了本發(fā)明。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種自然殺傷細(xì)胞擴(kuò)增的方法，該方法包括如 下步驟；（1)從全血中分離淋己細(xì)胞，并將淋己細(xì)胞接種在第一培養(yǎng)基中進(jìn)行第一擴(kuò)增培 養(yǎng)，得到第一擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)物；（2)將所述第一擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)物與第二培養(yǎng)基按1 ; (0. 5-2)的 體積比混合并進(jìn)行第二擴(kuò)增培養(yǎng)，得到第二擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)物；（3)將所述第二擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)物 替代第一擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)物返回步驟（2)的操作并循環(huán)進(jìn)行步驟（2)的操作2-7次；其中，所 述第一培養(yǎng)基含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基和5-30mg/mL的k谷氨酷胺、50-400IU/mL的硫酸慶大霉 素、2-20 y g/mL的甘露聚糖膚、300-1600IU/mL的白介素2、5-40ng/mL的抗人CD16單抗和 5-60ng/mL的白介素15 ;所述第二培養(yǎng)基含有5-30mg/mL的k谷氨酷胺、50-400IU/mL的 硫酸慶大霉素、2-20 y g/mL的甘露聚糖膚、300-1600lU/mL的白介素2、和5-60ng/mL的白介 素15。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)基組合物，所述培養(yǎng)基組合物含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基和 5-30mg/mL的k谷氨酷胺、50-400IU/mL的硫酸慶大霉素、2-20yg/mL的甘露聚糖膚、 300-1600IU/mL的白介素2和5-60ng/mL的白介素15。
[0011] 通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明提供了一種簡便、高效、易操作且安全性較高的自然 殺傷細(xì)胞擴(kuò)增方法，擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)1000-1500倍，CD3下D56+效應(yīng)自然殺傷細(xì)胞純度可達(dá)到 70% W上，殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)顯著，且培養(yǎng)成本較低。
[0012] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予W詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0013] 附圖是用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具 體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0014] 圖1是實(shí)施例1與對(duì)比例1得到的擴(kuò)增后的自然殺傷細(xì)胞對(duì)K562腫瘤細(xì)胞的殺 傷活性。
[0015] 圖2是實(shí)施例1與對(duì)比例1得到的擴(kuò)增后的自然殺傷細(xì)胞對(duì)化eG2腫瘤細(xì)胞的殺 傷活性。
[0016] 圖3是實(shí)施例1與對(duì)比例1得到的擴(kuò)增后的自然殺傷細(xì)胞對(duì)A549腫瘤細(xì)胞的殺 傷活性。
[0017] 圖4是實(shí)施例1擴(kuò)增得到的NK細(xì)胞治療后荷瘤小鼠的腹圍變化。
[0018] 圖5是實(shí)施例1擴(kuò)增得到的NK細(xì)胞治療后荷瘤小鼠生存曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0019] W下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描 述的【具體實(shí)施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0020] 在本發(fā)明中，在未作相反說明的情況下，使用的物料的體積數(shù)值均為1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大 氣壓的壓力和20°C的溫度下的數(shù)值。
[0021] 本發(fā)明提供一種自然殺傷細(xì)胞擴(kuò)增的方法，該方法包括如下步驟；（1)從全血中 分離淋己細(xì)胞，并將淋己細(xì)胞接種在第一培養(yǎng)基中進(jìn)行第一擴(kuò)增培養(yǎng)，得到第一擴(kuò)增培養(yǎng) 產(chǎn)物；(2)將所述第一擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)物與第二培養(yǎng)基按1 ; (0. 5-2)的體積比混合并進(jìn)行第二 擴(kuò)增培養(yǎng)，得到第二擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)物；(3)將所述第二擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)物替代第一擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)物 返回步驟（2)的操作并循環(huán)進(jìn)行步驟（2)的操作2-7次；其中，所述第一培養(yǎng)基含有基礎(chǔ)培 養(yǎng)基和5-30mg/mL的k谷氨酷胺、50-400IU/mL的硫酸慶大霉素、2-20 y g/mL的甘露聚糖 膚、300-1600IU/mL的白介素2、5-40ng/mL的抗人CD16單抗和5-60ng/mL的白介素15 ;所 述第二培養(yǎng)基含有5-30mg/mL的k谷氨酷胺、50-400IU/mL的硫酸慶大霉素、2-20 y g/mL 的甘露聚糖膚、300-1600IU/mL的白介素2、和5-60ng/mL的白介素15。
[0022] 其中，進(jìn)行了步驟（3)的操作之后得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中即含有擴(kuò)增得到的自然殺傷 細(xì)胞。
[0023] 其中，將淋己細(xì)胞接種在第一培養(yǎng)基中的接種濃度可W為巧-100) X 105個(gè)細(xì)胞/ 血培養(yǎng)基。
[0024] 其中，優(yōu)選地，將所述第一擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)物與第二培養(yǎng)基按1 ; (0.8-1. 2)的體積比 混合并進(jìn)行第二擴(kuò)增培養(yǎng)；更優(yōu)選地，將所述第一擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)物與第二培養(yǎng)基按1 ;1的體 積比混合并進(jìn)行第二擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0025] 其中，