一種人腦干細胞庫構建方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種人腦干細胞庫構建方法，屬于干細胞技術領域。
【背景技術】
[0002]在目前的專業(yè)干細胞庫中，有造血干細胞庫、脂肪干細胞庫、免疫細胞庫等，還沒有人腦干細胞庫既神經干細胞庫。
[0003]腦細胞是構成腦的多種細胞的通稱，腦細胞主要包括神經元和神經膠質細胞。神經元，又稱神經細胞，是構成神經系統(tǒng)結構和功能的基本單位。神經細胞屬于永久性細胞(permanent cells),是指不具有再生能力的細胞,此類細胞出生后即脫離細胞周期，永久停止有絲分裂。被公認為現代神經科學之父的諾貝爾生理學和醫(yī)學獎獲得者戈爾吉(Camillo Golgi 1843-1926)早在1906年首次向人們展示了大腦的微觀結構研究，提出哺乳動物中樞神經系統(tǒng)不能再生的理論。這一理論幾乎籠罩整個20世紀，桎梏了神經損傷修復的進步，致使中樞神經系統(tǒng)損傷的病人的治療方法僅局限于康復訓練和對癥處理，沒有做到促進受損神經的再生與修復，沒有從損傷的源頭上來治療該疾病，故療效很不盡人意，長期以來使這類疾病的治療陷入困境。
[0004]直到上世紀末，很多研究證明中樞神經系統(tǒng)損傷可以修復和再生。近年來的研究發(fā)現，移植的外源性的干細胞除具有自我更新、多向分化及向損傷部位遷移的潛能外，尚可分泌各種腦發(fā)育必需的神經生長因子及其他參與炎性反應的細胞因子，通過替代損傷的細胞、改善細胞生長的微環(huán)境、激活內源性的神經祖細胞構建新的神經網絡等方式，從根本上促進患者受損的腦組織的修復，以達到神經系統(tǒng)功能改善的目的。因此，干細胞移植是迄今為止治療中樞神經系統(tǒng)疾病最有前景的治療方法之一。
[0005]由于醫(yī)學倫理學的約束，移植異體神經干細胞受到限制，而自體神經干細胞的來源不像造血干細胞和脂肪干細胞來源方便，并且神經干細胞在冷凍環(huán)境下存儲時間短，一般只能存儲I年左右，而造血干細胞和脂肪干細胞都能達到30年之久，所以，社會上建設了很多造血干細胞庫和脂肪干細胞庫，卻一直沒有神經干細胞(腦干細胞)庫。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種神經干細胞庫的構建方法，并予以延長神經干細胞存儲時間。
[0007]為了實現上述目的，本發(fā)明的技術方案如下。
[0008]一種神經干細胞庫的構建方法，分為以下幾個步驟:
(I)GMP實驗室及冷凍庫的基礎建設:腦細胞庫由GMP實驗室和冷凍庫組成。
[0009](A) GMP實驗室:擁有符合國際GMP標準的現代化層流實驗室，總面積超過600平方米，分為:清潔區(qū)和非清潔區(qū)兩部分:(a)非清潔區(qū)包括:辦公區(qū)、值班室、庫房、洗刷消毒間和準備間、空調機房、微生物檢測室；(b)清潔區(qū)包括:男更衣室、女更衣室，潔凈度為30萬級；清潔走廊，潔凈度為10萬級；三個獨立的細胞制備室，潔凈度為萬級；腦組織初采分離室，潔凈度為萬級；配液室，潔凈度為萬級；檢測室，潔凈度為萬級；培養(yǎng)箱室，潔凈度為萬級。
[0010](B)冷凍庫:冷凍庫規(guī)模不同主要在于液氮罐數量，一般一個標準干細胞存儲液氮罐能存儲30萬份干細胞，需要使用面積為8平米。一個覆蓋一個省的腦細胞庫，需要具備60萬份存儲量，一般需要冷凍庫30平米，潔凈度為萬級。
[0011](2) GMP實驗室質控建設:嚴格按照以下神經干細胞操作培養(yǎng)規(guī)范進行，以確保質量控制:《臨床人體干細胞體外制備質量保證制度及工作表》、《人神經干細胞分離培養(yǎng)標準作業(yè)程序》、《人神經干細胞分離培養(yǎng)標準作業(yè)程序》、《人神經干細胞傳代培養(yǎng)標準作業(yè)程序》、《人神經干細胞收獲標準作業(yè)程序》、《人神經干細胞凍存標準作業(yè)程序》、《人神經干細胞復蘇標準作業(yè)程序》。
(3)神經干細胞培養(yǎng)流程，包括以下步驟:
(A)采集腦細胞:對需要手術的腦出血、腦外傷患者，先向家屬交代，手術只能進行止血、清除損傷的腦組織，但腦組織不能再生，損傷多少就減少多少，腦組織減少會對病人術后造成不同程度的影響，出現一定的殘疾。目前有干細胞技術，使得腦細胞可以在體外進行增殖，將損傷的腦組織進行提取其中的神經干細胞，進行體外增值，然后冷凍儲存，待病人以后所用。如病人家屬同意，術中將清除的損傷壞死的腦組織保留，存放在無菌袋中，36小時內入庫空運免檢，為了保證不變質，采集后的腦組織將被迅速送到GMP實驗室，本市24小時之內必須送到，外省市運送最多不能超過36小時(國際標準為72小時)。此外，運輸過程也有嚴格要求，腦組織會被放入一個特殊容器，溫度保持在4至25攝氏度之間。如果用飛機運送，腦組織在機場是免檢的，因為一旦經過X光照射，腦組織中神經干細胞的質量將受到影響。
[0012](B)神經干細胞的分離和傳代:沖洗腦組織，去除殘留的血液，D-Hanks液充分漂洗后，用眼科剪將腦組織剪碎后，再轉移到DMEM/F12(1:1)加B27和bFGF(20ng/ml)的無血清培養(yǎng)基，吸管吹打機械分離制作單細胞懸液，臺盼藍染色后細胞計數，調整細胞濃度為5X 14?5個/ml，置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔加入細胞懸液500 μ I。待神經球形成后再次機械分離克隆制作單細胞懸液，仍以5Χ 14個/ml的細胞濃度置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔加入細胞懸液500 μ I。此后每7d機械分離克隆傳代I次,方法同前。
[0013](C) BrdU標記:將BrdU溶于無血清培養(yǎng)基，過濾除菌后加入神經球形成后再次機械分離克隆制作的單細胞懸液中(BrdU終濃度為5 μ mol/L)，培養(yǎng)7d待新的神經球形成后，將神經球轉移到預先涂布有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中，貼壁2h行BrdU免疫細胞化學染色。
[0014](D)神經干細胞的誘導分化:選取部分上述傳代后形成的次代神經球種植于預先涂布有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中，并加入有血清培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM/F12)，一部分神經球于貼壁2h后行Nestin免疫細胞化學染色，另一部分神經球繼續(xù)培養(yǎng)，觀察其生長分化情況。另將一部分次代神經球機械分離制成單細胞懸液后加入有血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，7d后分別行Tujl ,GFAP ,Galc免疫細胞化學染色。
[0015](E)條件培養(yǎng)液的制備:取Ig雞胚的后肢骨骼肌組織，加入9mlD-Hanks液中冰浴勻漿15min，離心獲得上清液，過濾除菌后，加兩倍體積DMEM/F12培養(yǎng)基制成條件培養(yǎng)液備用。
[0016](F)神經干細胞的定向誘導分化:將一部分次代神經球機械分離制成單細胞懸液后分別加入條件培養(yǎng)液和有血清培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM/F12)中對照貼壁培養(yǎng)，7d后均行ChAT免疫細胞化學染色。
[0017](G)免疫細胞化學染色:培養(yǎng)細胞用4%多聚甲醛固定30min后，PBS充分漂洗，然后按ABC法分別行鼠抗Nestin，鼠抗Tujl，兔抗GFAP，鼠抗Galc，鼠抗Brdu免疫細胞化學染色，用DAB和H2O2作為呈色劑，陽性著色為棕黃色。具體方法為:1) 0.05M PBS漂洗10minX3 次；2) 0.3%H202/0.05M PBS 室溫 30min ；3) 0.3%Triton-100/0.05M PBS 37 °C,15min ；4) 0.05M PBS 漂洗 1minX3 次；5) 5% 羊血清/0.05M PBS 37 °C，15min;6) I 抗(2% 羊血清/0.05M PBS 配)4°C，48h;7) 0.05M PBS 漂洗 1minX 3 次；8) II 抗(2% 羊血清/0.05M PBS 配，1:200) 37 °C，1.5h;9) 0.05M PBS 漂洗 10minX3 次；10) AB 復合物(0.05M PBS 配，1:100) 37 °C, 1.5h ；11) 0.05M PBS 漂洗 10